Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

1. Perivasküler Kök Hücre İzolasyonu Bu, M. Corselli ve arkadaşları tarafından, bitişik makalesi "İnsan beyaz adipoz dokusu perivasküler Kök Hücreler saflaştırılması" de ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. 2. İskele Yaratılış İskelelerin poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA, Burmingham Polimer) hidroksiapatit kaplama 4-6 ile daha önce yayınlanmış protokol başına özel yapılır. Apatit kaplı PLGA iskeleleri çözücü döküm ve partikül liç işlemi ile PLGA 85/15 imal edilir. Iskelelerinin kas kese implantasyon, femoral segmental kusurlar için bir diskoid kalvarial implantasyon için şekil (4 mm çapında), veya silindir (4 mm çapında, 6 mm uzunluk) için bir küresel şekle (2-mm çap) oluşturulur. Kısaca, PLGA / kloroform çözümler ısmarlama eksilerini oluşturmak için 200-300-mikron çaplı teflon kalıp içine dökme sakkaroz (polimer / sakaroz oranı 5/95, w / w) ile karışıktruct. Gece dondurarak kurutma sonra, iskele teflon kalıp kaldırılır ve sukroz eritmek için GKD 2 O dalmış. Iskelelerinin GKD 2 O. üç durulama takiben, 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde daldırılarak dezenfekte Apatit kaplama için, yapay vücut sıvısı (SBF) çözümü sırayla GKD 2 O içinde CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 ve K 2 HPO 4 • 3H 2 O çözülmesiyle hazırlanmıştır Çözelti pH çözülürlüğünü artıracaktır 1M hidroklorik asit ilave edilerek 6 'e düşürülmüştür. Na 2 SO 4, KCl, ve NaCl eklenmiş ve nihai pH'ı 6.5 (SBF 1) 'e ayarlanır. Mg2 + ve HCO 3 – ücretsiz SBF (SBF 2) CaCl 2 ve GKD 2 O ve K 2 HPO 4 • 3H 2 O ekleyerek ve pH 6 indirilir tarafından hazırlanmıştır. KCl ve NaCl eklenmiş ve nihai pH'ı 6.8 'e ayarlanır. Bütün çözümler 0.22 um bir PES membr süzüldü sterildirane (Nalgene). Kaplama işlemi hemen önce, kurutulmuş PLGA iskelesi ıslatma ve kaplama yeknesaklık parıltı deşarjı iyileştirmek için argon plazma gravürü (harrick Scientific) tabi tutulur. Desenli iskeleleri sonra 12 saat SBF 1 inkübe ve Mg2 + ve HCO 3 değiştirilir – 37 başka bir 12 saat ücretsiz SBF 2 ° C nazik karıştırma altında. Kaplamalı iskeleleri fazla iyonları uzaklaştırmak için GKD 2 O ile yıkanır ve önceden ileri çalışmalar için liyofilize edilir. 3. Muscle Kılıfı Modeli İmplantasyonu PBS içinde bir PSC süspansiyon 100 ul (fosfat tamponlu tuz) hafifçe implantasyonu hemen önce küresel PLGA tabanlı implantın üzerine bırakılır. Hücreler bu nedenle in vivo izleme sonrası implantasyon izin verecek şekilde, Firefly lusiferaz of lentiviral ekleme tarafından önceden etiketli edilmiştir. Hücre yoğunluğu implant başına 2.5 x 10 5'tir. SCID (ağır kombine immün yetmezliği) farelerin yaş 6 hafta kullanılmaktadır. Hayvanlar anestezi vardırisofluran tarafından major'un ve buprenorfin (Bedford Labs) ile premedikasyon. Standart Betadine hazırlanmasından sonra, arka ayaklarda bilateral insizyon (uzunluğu boyuna ve 2 mm) yapılır. Cepler kas lifi uzun eksenine künt diseksiyon paralel biseps femoris kasları kesilir. Her fare için, PSC'ler ile PLGA tabanlı implant yerleştirilir ve kas örten fasya 5-0 Vicryl (Ethicon) ile sütüre edilir. Cilt yanındaki bir subkutiküler desen 5-0 vicryl ile kapatılır. 10 gün boyunca; Hayvanlar 48 saat ve TMP / SMX (Qualitest Trimetoprim / Sulfamethoxazole) için buprenorfin ile postoperatif tedavi edilir. 4. Kalvaryum Arıza Modeli İmplantasyonu SCID farelerinde (12-14 haftalık) ve izofluran anestezisi sonra, saçları kesilmiş ve cilt protokol başına betadin ile dezenfekte edilir. A 8 mm.lik kesi fare kalvaryumun orta sagital dikiş boyunca yapılır. Sonra, calvarial periost hafifçe Q-tip uygulama tarafından kaldırılır. Sonra, bir yüksek hızlı diş matkap elmaslı trepan bit kullanarak, 4 mm'lik parietal kemik defekti oluşturulur. Defekt tam kalınlıkta – ancak bakım altında yatan duramater kesmemeye alınır. Engrafted PSC'ler ile ısmarlama PLGA bazlı implant sonra kusurun sitesi içinde yavaşça yerleştirilir. Hücre yoğunluğu implant başına 2.5 x 10 5'tir. Son olarak, derinin 6-0 Vicryl ile dikilir edilir. Hayvanlar 48 saat ve 10 gün boyunca TMP / SMX için buprenorfin ile postoperatif tedavi edilir. 5.. Femoral bölüm Defekt Model İmplantasyonu Atimik sıçan (12-14 haftalık) isofluran anestezisi altında bulunmaktadır. Femur temizlendi ve betadin standart protokolü (Şekil 1) başına hazır. A 27-30-mm uzunlamasına insizyon femurun anterolateral yönü üzerinde yapılır. Femur sonra vastus lat ayırarak maruzeralis ve biseps femoris kasları (Şekil 2). Kemik rejenerasyonu tutarlılığı artırmak için femur kusur örten periost tamamen rezeke femoral segmentte ile kaldırılır. A plakalı polietilen (uzunluğu 23 mm; genişliği, 4 mm; yüksekliği, 4 mm) femur anterolateral yüzeyi üzerine yerleştirilir. Plaka 0.9 mm çapında yivli Kirschner (Zimmer) karşılamak için altı önceden delinmiş delikleri içerir. Bir şablon olarak plakası alarak, altı yivli Kirschner teli plakası ve iki korteksleri (Şekil 3) aracılığıyla delinir. Sonra, küçük bir el testeresi bıçağı (Stryker, MI) ile, 6 mm orta diafiz defekti oluşturulur. Defektlerinin sonra protokol uyarınca hücreleri (Şekil 4) yüklü olmuştur PLGA tabanlı implant yerleştirilmesi ile tedavi edilirler. Örten kas ve fasya yerine implant sabitlemek için 4-0 Vicryl emilebilir dikişlerle kapatılır ve cilt sütüre edilir. </li> 6. Vivo Değerlendirmeleri yılında Radyolojik değerlendirmeler yüksek çözünürlüklü XR ve yüksek çözünürlüklü μCT (mikro bilgisayarlı tomografi) analizi ikisi tarafından uzunlamasına bir şekilde yapılmaktadır. ΜCT analizi (Skyscan 1172F) için, resimler 19.73 mikron (100 kV ve 100 mA radyasyon kaynağı, bir 0.5 mm alüminyum filtre kullanılarak) çözünürlükte taranır. Görüntüler DataViewer, Recon, CTAN ve CTVol yazılımları kullanılarak analiz edilmektedir. Biyolüminesens görüntüleme aynı zamanda hücre transplantasyon, canlılığı, proliferasyon değerlendirmek ve implant sitenin göç dışlamak için bir seri şekilde yapılır. Biyolüminesens görüntüleme bir IVIS Lumina II cihazı (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanılarak yapılır. Işık çıkışı Living Image Software (Xenogen) kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Toplam ışık çıkışı fotonlar / ² / saniye cm / steradyan kaydedilir. Histolojik ve histomorfometrik analizi otopsi yapılır. Istihdam Rutin lekeleri Masson'un trikrom, anilin mavisi, p dahilentachrome ve Picrosirius kırmızı. Histomorfometrik analizi osteoid sırasıyla, mavi ve koyu sarı göründüğü, anilin mavisi veya pentachrome lekeleri ya kolayca yapılır. Yüksek güç alanı başına düşen piksel Adobe Photoshop'ta sihirli değnek aracı kullanılarak hesaplanmıştır. 7. Temsilcisi Sonuçlar Kalvaryal ve femoral kusurları kritik iki boyutlu olduğu için, anlamlı bir iyileşme büyüme faktörleri veya ekzojen kök hücreleri ile tedavi olmadan beklenmelidir. Cerrahi manevra açısından, kas kese Diseksiyon fascial düzlemler boyunca olmalıdır ve bu nedenle çok az kanama karşılaşılan edilmelidir. Kas kılıfı modeli bilateral olsa bile, fare postoperatif 1. günde rahatlıkla yürüyüş yapılmalıdır. Kalvaryal kusur için, kanama karşılaştı ama bir Q-tip ile ıslatılmış olabilir. Aşırı bakım yatan duramater kesmemeye dikkat edilmelidir – bu engel olacak şekildenormal iyileşme ile. FSD model için bakım nörolojik hasarı önlemek için aşırı kanama veya femoral sinir neden olmayacak şekilde büyük kan damarları kesmemeye alınır. Kirschner teli şekilde işleminde kortikal kemik zarar vermemek için nazik bir basınç ile delinir. Şekil 1.. Atimik Sıçanlarda Femoral bölüm Defekt için Ameliyat öncesi hazırlık (FSD). Erkek sıçanlarda (12-14 haftalık) isofluran anestezisi altında bulunmaktadır. Femur temizlendi ve betadin ile standart protokol başına prepped. Şekil 2. Femoral bölüm Defekt (FSD) oluşturulması için cerrahi pozlama. Bir 27-30 mm uzunlamasına insizyon femurun anterolateral yönü üzerinde yapılır. Femur lateral sonra vastus lateralis ayırarak maruzve biseps femoris kasları. Şekil 3. Femoral bölüm Defekt (FSD) oluşturulması için Fiksasyon. A plakalı polietilen (uzunluğu 23 mm; genişliği, 4 mm; yüksekliği, 4 mm) femur anterolateral yüzeyi üzerine yerleştirilir. Plaka 0.9 mm çapında yivli Kirschner karşılamak için altı önceden delinmiş delikleri içerir. Bir şablon olarak plaka alarak, altı yivli Kirschner plaka ve her iki korteks ile delinir. Sonra, 6 mm orta diafiz defekti oluşturulur. Bu gerçekleştirildikten sonra, bir ölçüye iskelesi doğrudan tam olarak hangi (gösterilmemiştir) kusurun sitesi uyan sokulur. Şekil 4. Postoperatif Kalvaryum Hata örneği. Bir 4 mm, dairesel kalvarial kusurun atimik farelerde sağ yan kemik oluşturulur. Görüntülü buraya takılan bir kusur sitesiAmeliyat sonrası 8 hafta PSC'ler. Defekt site içinde yeni kemik varlığını unutmayın.