Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de hueso<em> En vivo</em>.
Las células madre perivasculares (PSC) puede ser aislado en un número suficiente de múltiples tejidos para fines de tejido esquelético ingeniería 1-3. PSC son una población FACS-ordenados de 'pericitos' (CD146 + CD34-CD45-) y de células adventicias (CD146-CD34 + CD45-), cada uno de los cuales ya hemos informado que tienen propiedades de las células madre mesenquimales. PSC, como MSC, son capaces de someterse a la diferenciación osteogénica, así como secretan pro-osteogénico 1,2 citoquinas. En el presente protocolo, se demuestra la osteogenicity del PSC en varios modelos animales, incluyendo un implante de bolsa muscular en SCID (inmunodeficiencia combinada severa) en ratones, un defecto del ratón SCID del calvario y un defecto femoral segmentaria (FSD) en ratas atímicos. El músculo del muslo modelo de bolsa se utiliza para evaluar la formación de hueso ectópico. Defectos de calota se centran en el hueso parietal y son de forma estándar de 4 mm de diámetro (tamaño crítico) 8. FSD son bicortical y se estabilizan conuna barra de polietileno y 4 K-cables. El FSD descrito es también un defecto de tamaño crítico, que no curan significativamente en su propio 4. Por el contrario, si las células madre o factores de crecimiento son añadidos al sitio del defecto, la regeneración ósea significativa se puede apreciar. El objetivo general de xenoinjerto PSC es demostrar la capacidad osteogénica de este tipo de células en modelos de regeneración tanto ectópicos y hueso ortotópico.
El aislamiento del PSC está bien descrito en otra parte 03.01, incluyendo una publicación por separado Jove presentó específicamente a los protocolos de aislamiento del PSC y los métodos. El propósito específico de este artículo es describir y demostrar 3 protocolos de PSC en la aplicación in vivo para la formación de hueso / regeneración. La bolsa muscular de ratón SCID es un modelo comúnmente descrito para la formación ectópica de hueso humano 7. Existen importantes diferencias entre ectópicos y ortotópico (defecto) los modelos de los huesos, incluyendo la interacción con los receptores que forman paracrina ósea las células 8, así como una gran cantidad de factores osteogénicos de señalización presentes en el microambiente del defecto óseo. Dos defectos se presentan aquí, un defect8 calota y el defecto femoral segmentaria 4. Ambos están bien documentados a ser crítico de tamaño (es decir, no se curan por sí solas).
Existen diferencias interesantes entre los defectos craneales y femorales. En primer lugar, elcelular: la interacción entre las células y las células PSC xenoinjertados endógenos es muy diferente. En términos de un defecto craneal, PSC interactuar con la duramadre subyacente (la capa más externa de las meninges), así como aquellos osteoblastos y células periósticos que circunscriben el sitio del defecto. Es importante destacar que la interacción entre las células implantadas y los osteoblastos que rodean 8, o de las células implantadas y que subyace a la duramadre (Levi et al., En prensa) son fundamentales para la célula madre normal mediada la osteogénesis para continuar. En términos del defecto femoral segmentaria (FSD), PSC xenoinjertados están expuestos a una celda muy diferente y el medio ambiente de citoquinas. Por ejemplo, el sitio FSD se compone de las células madre de médula ósea y de acompañamiento mesenquimales, así como el endostio, periostio y los osteoblastos de huesos largos. En teoría, cada célula tiene su propia reacción a una lesión, y cada uno puede tener de células: las interacciones celulares con xenoinjertos PSC.
Otras claras diferencias existen entre la calotay los defectos femorales. Los huesos craneales inicialmente forman a través de osificación intramembranosa, mientras que los huesos se forman largas a través de un intermedio de cartílago (osificación endocondral). Por otra parte, el proceso de reparación después de la lesión también imita estos orígenes evolutivos. Después de la FSD, la formación de cartílago de callos se observa, mientras que no intermedia del cartílago se forma dentro de un defecto de hueso parietal. Finalmente, el origen embrionario del cráneo puede diferir de la de los huesos largos. La mayoría del cráneo (incluyendo las células perivasculares – pericitos – en la región de la cabeza entera) se deriva de la cresta neural (mesectoderm), mientras que el esqueleto apendicular es de derivación mesodermo paraxial 9. Todas estas diferencias pueden resultar en diferencias significativas en cuanto a la reparación ósea mediada por PSC.
El uso de la PSC tiene varias ventajas sobre los tradicionales derivadas de tejido adiposo células del estroma (ASC). PSC no requieren de la cultura y son una población de células purificadas WHIch no incluye otras células del estroma que no participan en el – e incluso se puede regular negativamente – la diferenciación osteogénica, como las células endoteliales 10. En contraste, por ejemplo, los análisis clonales de ASCs muestran que sólo una subpoblación son capaces de experimentar diferenciación osteogénica in vitro 11. En última instancia, los esfuerzos de ingeniería de tejidos esqueléticos probable que incorpore una célula madre osteocompetent (como PSC) con factores de crecimiento exógenos y un osteoconductivo andamio (tales como HA-PLGA utilizada en los presentes métodos) para curar mejor defectos óseos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el CIRM Temprana Premio de Investigación Traslacional II TR2-01821, NIH / NIDCR (subvenciones R21 DE0177711 y DE01607 SR1), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ y RKS tienen T32 becas becas de capacitación (5T32DE007296-14), JNZ tiene una beca de formación CIRM (TG2-01169).