L'uso di cellule staminali per la rigenerazione ossea perivascolari

1. Perivascolare Stem isolamento cellulare Questo è descritto in dettaglio nella adiacente "purificazione delle cellule staminali umane perivascolari da tessuto adiposo bianco" articolo di M. Corselli et al. 2. Scaffold Creation Ponteggi sono su misura per il protocollo precedentemente pubblicato da poli (lattico-co-glicolico) (PLGA, Burmingham Polymer) con rivestimento in idrossiapatite 4-6. Apatite rivestite impalcature PLGA sono fabbricati da 85/15 PLGA da solvente per colata e un processo di lisciviazione particolato. Le impalcature sono creati in una forma sferica (2-mm di diametro) per l'impianto muscolo sacchetto, una forma discoidale (4 mm di diametro) per l'impianto cranica, o cilindrica (4 mm di diametro, 6 mm di lunghezza) per femorale difetti segmentale. In breve, PLGA / cloroformio soluzioni miste con saccarosio (polimero / rapporto meno di 5/95, w / w) sono fusi in uno stampo del diametro di 200-300-micron Teflon per creare su misura construct. Dopo liofilizzazione overnight, ponteggi vengono rimosse dallo stampo e Teflon immerso in ddh 2 O per sciogliere il saccarosio. Le impalcature sono disinfettati per immersione in 70% etanolo per 30 min, seguito da tre lavaggi di ddh 2 O. Per rivestimento di apatite, un fluido corporeo simulato soluzione (SBF) viene preparata sciogliendo sequenzialmente CaCl 2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3, e K 2 HPO 4 • 3H 2 O in ddh 2 O. PH della soluzione si abbassa a 6 con l'aggiunta di acido cloridrico 1M per aumentare la solubilità. Na 2 SO 4, KCl, e NaCl vengono aggiunti e il pH finale viene regolata a 6,5 (SBF 1). Mg2 + e HCO 3 – libera SBF (SBF 2) viene preparata aggiungendo CaCl 2 e K 2 HPO 4 • 3H 2 O in ddh 2 O e si abbassa il pH a 6. KCl e NaCl vengono aggiunti e il pH finale viene regolata a 6,8. Tutte le soluzioni sono sterili filtrata attraverso un membr 0,22 micron PESAne (Nalgene). Immediatamente prima del processo di rivestimento, i ponteggi essiccati PLGA sono sottoposti a bagliore scarico plasma di argon etching (Harrick Scientific) per migliorare la bagnatura e uniformità di rivestimento. Etched ponteggi vengono poi incubate in SBF 1 per 12 ore e cambiato Mg2 + e HCO 3 – libero SBF 2 per un'altra h 12 a 37 ° C sotto leggera agitazione. Ponteggi rivestiti vengono lavati con ddh 2 O per rimuovere gli ioni in eccesso e liofilizzati prima di ulteriori studi. 3. Il Muscle Pouch impianto modello 100 pl di una sospensione PSC in PBS (tampone fosfato salino) sono delicatamente cadere sulla sferica PLGA basato impianto subito prima dell'impianto. Le cellule sono state pre-etichettato mediante inserimento lentivirale luciferasi di lucciola, così da consentire dopo l'impianto in vivo inseguimento. Densità cellulare è di 2,5 x 10 5 per ogni impianto. SCID (grave immunodeficienza combinata), i topi sono utilizzati a 6 settimane di età. Gli animali sono anesthetized per inalazione isoflurano e premedicazione con buprenorfina (Bedford Labs). Dopo la preparazione Betadine standard, incisioni bilaterali negli arti posteriori sono realizzati (longitudinale e 2 mm di lunghezza). Tasche vengono tagliati nei muscoli bicipite femorale da parallelo smussa all'asse della fibra muscolare lungo. Per ciascun topo, il PLGA basata impianto con PSC viene inserito, e la fascia sovrastante il muscolo viene suturata con 5-0 Vicryl (Ethicon). La pelle è chiusa con successivo 5-0 Vicryl in un modello sottocuticolare. Gli animali vengono trattati nel postoperatorio con buprenorfina per 48 ore e TMP / SMX (trimetoprim / sulfametossazolo; Qualitest) per 10 giorni. 4. Il cranica Defect impianto modello Dopo l'anestesia isoflurano di topi SCID (12-14 settimane), i capelli sono tagliati e la pelle disinfettato con Betadine per protocollo. A 8 mm incisione cutanea è praticata lungo la sutura sagittale della volta cranica topo. Successivamente, il CALVarial periostio viene delicatamente rimosso da Q-tip applicazione. Successivamente, utilizzando diamantate punte trapano in un trapano ad alta velocità dentale, uno da 4 mm difetto parietale è stato creato. Il difetto è tutto spessore – tuttavia si ha cura di non danneggiare il sottostante dura mater. La misura PLGA-based impianto con PSC trapiantati viene poi messo delicatamente nel sito del difetto. Densità cellulare è di 2,5 x 10 5 per ogni impianto. Infine, la cute viene suturata con 6-0 Vicryl. Gli animali vengono trattati nel postoperatorio con buprenorfina per 48 ore e TMP / SMX per 10 giorni. 5. Il difetto femorale segmentale impianto modello Atimici ratti (12-14 settimane di età) sono anestetizzati con isoflurano inalazione. Il femore è rimosso e preparato secondo la procedura standard con Betadine (Figura 1). A 27-30-millimetri incisione longitudinale è realizzata sulla faccia antero-laterale del femore. Il femore è quindi esposto separando il lat vastoeralis e muscoli bicipite femorale (Figura 2). Per massimizzare la coerenza di rigenerazione ossea, il periostio sovrastante il difetto femorale viene completamente rimosso con il segmento asportato femorale. Una piastra di polietilene (lunghezza, 23 mm, larghezza, 4 mm, altezza, 4 mm) è posto sulla superficie antero-laterale del femore. La piastra contiene sei fori predisposti per accogliere 0,9 mm di diametro fili di Kirschner filettati (Zimmer). Prendendo la piastra come modello, sei fili di Kirschner filettati sono perforati attraverso la piastra ed entrambe le corticali (Figura 3). Successivamente, con una lama piccola sega oscillante (Stryker, MI), a 6 mm mid-diafisario difetto è stato creato. Difetti segmentali vengono poi trattati con l'inserimento di impianti PLGA base che sono stati carica di celle come da protocollo (Figura 4). Il muscolo e la fascia sovrastante sono chiusi con 4-0 punti di sutura riassorbibili Vicryl per fissare l'impianto in posizione, e la pelle viene suturata. </li> 6. Valutazioni in vivo Valutazioni radiografiche sono eseguite in maniera longitudinale sia XR alta risoluzione e ad alta risoluzione μCT (micro tomografia computerizzata) analisi. Per l'analisi μCT (Skyscan 1172F), le immagini sono state scansionate ad una risoluzione di 19,73 micron (100 kV e 100 mA sorgente di radiazione, utilizzando un filtro in alluminio da 0,5 mm). Le immagini sono analizzate utilizzando DataViewer, Recon, CTAN e software CTVol. Immagini bioluminescenza è anche fatto in modo seriale per valutare l'attecchimento delle cellule, vitalità, proliferazione ed escludere la migrazione dal sito dell'impianto. Immagini bioluminescenza è effettuato con un dispositivo di IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Uscite di luce vengono quantificati utilizzando il software Living Image (Xenogen). Emissione luminosa complessiva è registrata in fotoni / secondo / cm ² / steradiante. L'analisi istologica e istomorfometrica viene eseguito post mortem. Macchie di routine impiegate includono Masson tricromica, blu di anilina, pentachrome, e Picrosirius rosso. L'analisi istomorfometrica viene eseguita facilmente con uno blu anilina o macchie pentachrome, in cui appare osteoide blu scuro e giallo, rispettivamente. Pixel per campo di alta potenza sono calcolati utilizzando lo strumento bacchetta magica in Adobe Photoshop. 7. Risultati rappresentativi Poiché entrambi i difetti cranica e femorale sono critiche imprese, non significativa la guarigione dovrebbe essere previsto senza trattamento con fattori di crescita o cellule staminali esogeni. In termini di manovre chirurgiche, la dissezione sacca muscolare dovrebbe essere lungo i piani fasciali e quindi sanguinamento minimo si dovrebbero incontrare. Anche se il modello sacca muscolare viene eseguita bilateralmente, il mouse deve essere a piedi con facilità il giorno postoperatorio 1. Per il difetto cranico, emorragia si incontra, ma può essere intrisa di una Q-tip. Prestare estrema attenzione a non ferire la dura sottostante dura – perché questo potrebbe interferirecon la guarigione normale. Per il modello FSD, si ha cura di non danneggiare i vasi sanguigni più importanti in modo da non provocare un sanguinamento eccessivo o il nervo femorale per evitare danni neurologici. Fili di Kirschner sono perforati con una leggera pressione in modo da non danneggiare l'osso corticale nel processo. Figura 1. Preparazione preoperatoria per difetto di femore (FSD) nei ratti atimici. Ratti maschi (12-14 settimane di età) sono anestetizzati con isoflurano inalazione. Il femore è rimosso e preparata secondo la procedura standard con Betadine. Figura 2. L'esposizione chirurgica per femorale segmentale Defect (FSD) creazione. A 27-30 millimetri incisione longitudinale è realizzata sulla faccia antero-laterale del femore. L'aspetto laterale della diafisi femorale è quindi esposto separando il vasto lateralebicipite femorale e muscoli. Figura 3. Di fissaggio per femorale segmentale Defect (FSD) creazione. Una piastra di polietilene (lunghezza, 23 mm, larghezza, 4 mm, altezza, 4 mm) è posto sulla superficie antero-laterale del femore. La piastra contiene sei fori predisposti per accogliere 0,9 mm di diametro fili di Kirschner filettati. Prendendo la piastra come modello, sei fili di Kirschner filettati sono perforati attraverso la piastra ed entrambe le corticali. Successivamente, da 6 mm mid-diafisario difetto viene creato. Una volta che questo viene eseguita una misura scaffold è inserito direttamente che si adatta esattamente sito del difetto (non mostrato). Figura 4. Esempio di difetto cranico post-operatorio. A mm 4, difetto circolare cranica viene creato nel parietale destro nei topi atimici. Creata l'immagine qui è un sito del difetto impiantati conPSC a 8 settimane post-operatorie. Si noti la presenza di nuovo tessuto osseo all'interno del sito del difetto.