Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

1. Perivasculaire Stem Cell Isolatie Dit wordt in detail beschreven in de aangrenzende artikel "Zuivering van perivasculaire stamcellen van menselijke vetweefsel", door M. Corselli et al.. 2. Steiger Creation Steigers zijn op maat gemaakt per eerder gepubliceerde protocol van poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA, Burmingham Polymer) met hydroxyapatiet coating 4-6. Apatiet gecoate PLGA steigers zijn vervaardigd uit 85/15 PLGA Met behulp van oplosmiddelen gieten en een fijn uitloging proces. Steigers zijn gemaakt in een bolvorm (2 mm) voor spierzakje implantatie een schijfvormige vorm (4 mm) voor calvarial implantatie of cilindrisch (4 mm diameter 6 mm lengte) voor femorale segmentale defecten. In het kort, PLGA / chloroform oplossingen gemengd met sucrose (polymeer / sucrose verhouding 5/95, w / w) zijn gegoten in een 200-300-um een ​​diameter van Teflon mal om de custom-made cons makentruct. Na het vriesdrogen 's nachts, zijn steigers verwijderd uit de Teflon mal en ondergedompeld in DDH 2 O om de sucrose te ontbinden. Steigers worden gedesinfecteerd door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 30 min, gevolgd door drie spoelingen van DDH 2 O. Voor apatiet coating, wordt een gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF) oplossing bereid door achtereenvolgens het oplossen van CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 en K 2 HPO 4 • 3H 2 O in DDH 2 O. PH wordt verlaagd tot 6 door toevoeging van 1 M zoutzuur om de oplosbaarheid te verbeteren. Na 2 SO 4, KCl, NaCl en toegevoegd en de uiteindelijke pH op 6,5 (SBF 1). Mg2 + en HCO 3 – vrije SBF (SBF 2) wordt bereid door toevoeging CaCl2 en K2 HPO 4 • 3H 2 O 2 O in DDH en pH verlaagd wordt tot 6. KCl en NaCl toegevoegd en de uiteindelijke pH op 6,8. Alle oplossingen zijn steriel gefiltreerd door een 0,22 pm PES membrane (Nalgene). Direct voorafgaand aan de coating proces worden de gedroogde PLGA steigers onderworpen aan glimontlading argon plasma-etsen (Harrick Scientific) te bevochtigen en coaten uniformiteit te verbeteren. Geëtst steigers vervolgens geïncubeerd in SBF 1 voor 12 uur en veranderd Mg2 + en HCO 3 – vrij SBF 2 met 12 uur bij 37 ° C onder voorzichtig roeren. Coated steigers worden gewassen met DDH 2 O om het overtollige ionen te verwijderen en voorafgaand aan verdere studies gevriesdroogd. 3. De Muscle Pouch Model Implantatie 100 ul van een PVC suspensie in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) worden voorzichtig vallen op het bolvormige PLGA gebaseerde implantaat onmiddellijk voorafgaand aan implantatie. Cellen werden gelabelde door lentivirus inbrengen van vuurvlieg luciferase, om mogelijk in vivo volgen na implantatie. Cel dichtheid is 2,5 x 10 5 per implantaat. SCID (ernstige gecombineerde immunodeficiëntie) muizen worden gebruikt op 6 weken oud. Dieren zijn Anesthetized door isofluraan inademing en premedicatie met buprenorfine (Bedford Labs). Na standaard Betadine bereiding worden bilaterale insnijdingen in de achterpoten gemaakt (lengte en 2 mm lengte). Zakken worden gesneden in de biceps femoris spieren door stompe dissectie parallel aan de spiervezels lange as. Voor elke muis, wordt de PLGA-gebaseerde implantaat met PSC's geplaatst en de fascia bovenop de spier wordt gehecht met 5-0 Vicryl (Ethicon). De huid wordt volgende gesloten met 5-0 Vicryl in een subcutane patroon. De dieren worden na de operatie behandeld met buprenorfine voor 48 uur en TMP / SMX (trimethoprim / sulfamethoxazol, Qualitest) gedurende 10 dagen. 4. De Calvarial Defect Model Implantatie Na isofluraananesthesie van SCID muizen (12-14 weken oud), wordt het haar geknipt en de huid ontsmet met betadine per protocol. Een 8-mm incisie in de huid gebeurt langs het midden van de pijlnaad van de muis calvarium. Vervolgens wordt de Calvarial periost wordt voorzichtig verwijderd door Q-tip applicatie. Vervolgens wordt met behulp gediamanteerd trephine bits in een snelle tandartsboor wordt een 4 mm wandbeen defect gemaakt. Het defect is de volledige dikte – hoe zorg wordt genomen niet aan de onderliggende dura mater verwonden. De op maat gemaakte PLGA-gebaseerde implantaat met geënt PSC's wordt vervolgens voorzichtig geplaatst in het defect site. Cel dichtheid is 2,5 x 10 5 per implantaat. Ten slotte wordt de huid gehecht met 6-0 Vicryl. De dieren worden na de operatie behandeld met buprenorfine voor 48 uur en TMP / SMX gedurende 10 dagen. 5. De Femorale segmentaal defect Model Implantatie Athymische ratten (12-14 weken oud) zijn verdoofd onder isofluraan inademing. Het dijbeen is geschrobd en bereide per standaard protocol met betadine (figuur 1). Een 27-30-mm longitudinale incisie wordt gemaakt over de anterolaterale aspect van het dijbeen. De femurschacht wordt vervolgens blootgesteld door het scheiden van de vastus lateralis en biceps femoris spieren (figuur 2). Om de consistentie van botregeneratie te maximaliseren, wordt het periost bovenop de femorale defect volledig verwijderd met de verwijderde femorale segment. Een polyetheen plaat (lengte 23 mm, breedte, 4 mm, hoogte, 4 mm) wordt op de anterolaterale oppervlak van de femur. De plaat bevat zes voorgeboorde gaten om tegemoet 0,9 mm diameter schroefdraad Kirschner draden (Zimmer). Inname van de plaat als een sjabloon, worden zes schroefdraad Kirschner draden geboord door de plaat en beide cortex (Figuur 3). Vervolgens een kleine oscillerende zaagblad (Stryker, MI), wordt een 6 mm midden diaphyseal defect gemaakt. Gesegmenteerde defecten worden behandeld door het inbrengen van PLGA gebaseerde implantaten die zijn beladen met cellen volgens het protocol (figuur 4). De bovenliggende spier-en fascia zijn gesloten met 4-0 Vicryl resorbeerbare hechtingen om het implantaat vast te zetten, en de huid wordt gehecht. </li> 6. In vivo beoordelingen Radiografische evaluaties worden uitgevoerd in een longitudinale manier door zowel een hoge resolutie XR en een hoge resolutie μCT (micro CT) analyse. Voor μCT analyse (Skyscan 1172F), worden de beelden gescand met een resolutie van 19,73 urn (100 kV en 100 mA stralingsbron met een 0,5 mm aluminium filter). Afbeeldingen worden geanalyseerd met behulp van Dataviewer, Recon, CTAN en CTVol software. Bioluminescentie beeldvorming gebeurt ook in een seriële manier naar cel engraftment, levensvatbaarheid, de proliferatie te beoordelen en uit te sluiten uit de migratie van het implantaat site. Bioluminescentie beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een IVIS Lumina II apparaat (Remklauw Life Sciences). Licht uitgangen worden gekwantificeerd met behulp van Living Image software (Xenogen). Totaal lichtopbrengst is opgenomen in fotonen / seconde / cm ² / steradiaal. Histologische en histomorfometrische analyse wordt uitgevoerd postmortem. Werkzaam Routine vlekken zijn Masson trichroom, aniline blauw, pentachrome en Picrosirius rood. Histomorfometrische analyse is eenvoudig uitgevoerd met ofwel aniline blauw of pentachrome vlekken, waarin osteoid er donker blauw en geel, respectievelijk. Pixels per high powered veld worden berekend met behulp van de toverstaf in Adobe Photoshop. 7. Representatieve resultaten Omdat zowel de calvarial en femorale gebreken zijn kritische grootte, geen grote genezing worden verwacht zonder behandeling met groeifactoren of exogene stamcellen. Op het gebied van chirurgische manoeuvres, moet het spierzakje dissectie zijn langs de fascia vliegtuigen en dus een minimale bloeding moet worden aangetroffen. Hoewel het spierzakje model wordt bilateraal uitgevoerd, moet de muis te lopen met gemak op postoperatieve dag 1. Voor de calvarial gebrek, wordt bloedingen aangetroffen, maar kan worden geweekt met een Q-tip. Uiterst voorzichtig moeten worden genomen niet aan de onderliggende dura mater verwonden – want dit zal interfererenmet normale heling. Voor de FSD-model, wordt erop toegezien dat niet te verwonden van de grote bloedvaten geen te zware bloedingen of de femorale zenuw veroorzaken neurologische schade te voorkomen. Kirschner draden worden geboord met een lichte druk om niet het corticale bot in het te beschadigen. Figuur 1. Preoperatieve voorbereiding op Femorale segmentaal defect (FSD) in athymische ratten. Mannelijke ratten (12-14 weken oud) zijn verdoofd onder isofluraan inademing. Het dijbeen is geschrobd en voorbereid per standaard protocol met betadine. Figuur 2. Chirurgische blootstelling voor Femorale segmentaal defect (FSD) creatie. Een 27-30 mm longitudinale incisie wordt gemaakt over de anterolaterale aspect van het dijbeen. De buitenzijde van de femurschacht wordt vervolgens belicht door het scheiden van vastus lateralisen biceps femoris spieren. Figuur 3. Fixatie voor Femorale segmentaal defect (FSD) creatie. Een polyetheen plaat (lengte 23 mm, breedte, 4 mm, hoogte, 4 mm) wordt op de anterolaterale oppervlak van de femur. De plaat bevat zes voorgeboorde gaten tot 0,9 mm diameter schroefdraad Kirschner draden tegemoet te komen. Inname van de plaat als een sjabloon, worden zes schroefdraad Kirschner draden geboord door de plaat en beide cortex. Vervolgens wordt een 6 mm midden diaphyseal defect gemaakt. Als dit eenmaal is uitgevoerd, wordt een op maat gemaakte steiger direct geplaatst en dat is precies het defect website past (niet afgebeeld). Figuur 4. Voorbeeld van Calvarial Defect na de operatie. Een 4 mm, cirkelvormige calvarial defect wordt in de juiste wandbeen in muizen zonder thymus. Afgebeeld is hier een defectlocatie geïmplanteerdPSC's na 8 weken na de operatie. Let op de aanwezigheid van nieuw bot in het defect.