Использование прав Периваскулярная стволовых клеток для регенерации костной

1. Периваскулярная Выделение стволовых клеток Это подробно описано в соседней статье "Очистка Периваскулярная стволовых клеток человека из белой жировой ткани", М. Corselli соавт. 2. Создание лесов Строительные леса на заказ в ранее опубликованных протоколов из поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA, Burmingham полимер) с покрытием 4-6 гидроксиапатита. Апатит покрытием PLGA леса изготавливаются из 85/15 PLGA растворителем литья и процесс выщелачивания частиц. Строительные леса, создаются в сферической формы (2 мм в диаметре) для мышечной сумке имплантации, дискоидная формы (диаметром 4 мм) для свода имплантации, или цилиндрических (диаметром 4 мм, 6 мм в длину) для бедренных сегментарных дефектов. Короче говоря, PLGA / хлороформ решения смешанной с сахарозой (полимер / сахароза соотношение 5/95, в / в) подаются в 200-300-мкм в диаметре тефлоновые формы для создания заказных минусытракте. После сублимационной сушки в течение ночи, леса удаляют из формы тефлон и погружается в DDH 2 O растворить сахарозу. Леса дезинфицируют путем погружения в 70% этаноле в течение 30 мин, затем три полоскания в DDH 2 O. Для апатита покрытия, моделирование жидкости организма (SBF) раствор готовят последовательным растворением 2 CaCl, MgCl 2 • 6H 2 O, NaHCO 3, K 2 HPO 4 • 3H 2 O в DDH 2 O. Решение рН снижается до 6, добавив 1М соляной кислоты для увеличения растворимости. Na 2 SO 4, KCl, NaCl и добавляются и окончательное рН доводят до 6,5 (SBF 1). Mg 2 + и HCO 3 – бесплатно SBF (SBF 2) получают путем добавления CaCl 2 и K 2 HPO 4 • 3H 2 O в DDH 2 O и рН снижается до 6. KCl и NaCl добавляется и окончательное рН доводят до 6,8. Все решения являются стерильными фильтруют через 0,22 мкм PES membrANE (Nalgene). Непосредственно перед началом процесса нанесения покрытия, сухие строительные леса PLGA подвергаются тлеющем разряде аргона плазменного травления (Harrick Научно) для улучшения смачивания и покрытия единообразия. Гравированный леса, затем инкубировали в SBF 1 за 12 ч и перешли на Mg 2 + и HCO 3 – бесплатно SBF 2 еще 12 ч при температуре 37 ° С при легком помешивании. Покрытые лесом промывают DDH 2 O, чтобы удалить избыток ионов и лиофилизируют до дальнейших исследований. 3. Модель мышц Чехол имплантации 100 мкл суспензии PSC в PBS (фосфатный буферный раствор) мягко упала на сферической PLGA основе имплантата непосредственно перед имплантацией. Клетки были предварительно помечены лентивирусов вставки Светлячок люциферазы, с тем чтобы обеспечить в естественных условиях отслеживания после имплантации. Сотовые плотностью 2,5 · 10 5 на имплантат. SCID (тяжелым комбинированным иммунодефицитом) мышей используются в возрасте 6 недель. Животные ANESthetized по ИФ вдыхании и premedicated с бупренорфин (Bedford Labs). После стандартного препарата Бетадин, двусторонних разрезов в задних конечностей производятся (продольных и 2 мм в длину). Карманы режутся в двуглавой мышцы бедра на тупое рассечение параллельно на мышечное волокно длинной оси. Для каждой мыши, PLGA основе имплантата с СРП установлена, и фасции покрывающей мышцы зашивается с 5-0 Викрил (Ethicon). Кожа следующий закрыта с 5-0 Викрил в подкожный картины. Животные лечатся после операции с бупренорфин в течение 48 часов и TMP / SMX (триметоприм / сульфаметоксазол, QualiTest) в течение 10 дней. 4. Имплантация свода модели дефектов После ИФ анестезии SCID мышей (12-14 недель), волосы обрезаются и дезинфицируют кожу бетадин в протокол. 8-мм разрез кожи производится по средней сагиттальной шва черепа мыши. Далее, CalvArial надкостница осторожно удалить Q-Tip приложения. Далее, используя алмазный трепана бит в высокоскоростной бормашины, 4 мм дефект теменной кости создается. Дефект полной толщины – Однако внимание уделяется не повредить основной твердой мозговой оболочки. Заказ PLGA основе имплантата с насаждаемое ЭСК помещается мягко дефекта сайта. Сотовые плотностью 2,5 · 10 5 на имплантат. Наконец, кожа зашивается с 6-0 Викрил. Животные лечатся после операции с бупренорфин в течение 48 часов и TMP / SMX течение 10 дней. 5. Бедренной Сегментные Имплантация модели дефектов Бестимусных крыс (12-14 недель) анестезируют под ИФ ингаляции. Бедра промывается и готовые в стандартный протокол с бетадин (рис. 1). 27-30-мм продольный надрез на переднебоковой бедренной кости. Бедренной кости затем подвергаются путем разделения широкая мышца бедра латeralis и двуглавой мышцы бедра мышцы (рис. 2). Для обеспечения максимальной согласованности регенерации кости, надкостница покрывающих бедра дефект полностью удаляется с удаленной бедренного сегмента. Полиэтилен пластиной (длина 23 мм, ширина 4 мм, высота 4 мм) находится на переднебоковой поверхности бедра. Пластина состоит из шести предварительно просверленные отверстия для размещения диаметром 0,9 мм с резьбой провода Киршнер (Zimmer). Принимая пластину в качестве шаблона, шесть резьбовых провода Киршнер бурятся через пластину и так коры (рис. 3). Далее, с небольшим осциллирующей пилы (Stryker, MI), 6-мм середине диафизарных дефектов создается. Сегментные дефекты затем обрабатывают путем введения PLGA основе имплантатов, которые были нагруженные клетки, в соответствии с протоколом (рис. 4). Вышележащие мышцы и фасции закрыты 4-0 Викрил рассасывающиеся швы, чтобы обеспечить имплантат на месте, а кожа зашивается. </li> 6. В Vivo оценки Рентгенологические оценки выполняются в продольном способом, как высокое разрешение и XR с высоким разрешением μCT (микро компьютерная томография) анализа. Для μCT анализа (Skyscan 1172F), изображения будут отсканированы с разрешением 19,73 мкм (100 кВ и 100 мА источника излучения, с помощью 0,5 мм алюминиевый фильтр). Изображения анализировали с помощью DataViewer, Recon, CTAN, и CTVol программного обеспечения. Биолюминесценция изображений производится также в сериале образом для оценки приживления клетки, жизнеспособность, пролиферацию и миграцию исключить из имплантата. Биолюминесценция изображений осуществляется с помощью ИВИС Lumina II устройство (суппорт Life Sciences). Свет выходы количественно, используя программное обеспечение жизни изображения (Xenogen). Общий объем свет отражается в фотонов / сек / см / стерадиан. Гистологическое и гистоморфометрическое анализ проводится посмертно. Обычные пятна использованы, включают трехцветного Массона, анилин синий, рentachrome и Picrosirius красный. Гистоморфометрическое анализ выполняется легко с любой анилин синий или pentachrome пятна, в котором остеоида появляется темно-синий и желтый, соответственно. Пиксели на высокой мощности поля рассчитывается по волшебной палочкой в ​​Adobe Photoshop. 7. Представитель Результаты Так как оба свода черепа и бедренной дефекты критического размера, без существенных исцеления следует ожидать без лечения с факторами роста или экзогенных стволовых клеток. С точки зрения хирургических маневров, рассечение мышц сумка должна быть вдоль фасциальных самолетов и, таким образом минимальное кровотечение должно возникнуть. Хотя модель мышцы сумка осуществляется двусторонней основе, мышь должна ходить с легкостью на день после операции 1. Для свода дефект, кровотечения встречается, но может быть пропитана Q-Tip. Экстремальные следует позаботиться, чтобы не повредить основной твердой мозговой оболочки – как это будет мешатьс нормального заживления. Для FSD модели, приняты меры, чтобы не повредить крупные кровеносные сосуды, чтобы не вызвать кровотечения или бедренного нерва для предотвращения неврологических повреждений. Киршнер провода сверлят с легким нажимом, чтобы не повредить кортикальной кости в этом процессе. Рисунок 1. Предоперационная подготовка к бедренной сегментных дефектов (ФУР) в бестимусных крыс. Самцов крыс (12-14 недель) анестезируют под ИФ ингаляции. Бедра промывается и нацелен на стандартный протокол с бетадин. Рисунок 2. Хирургическое воздействие на бедренной сегментных дефектов (ФУР) творчества. 27-30 мм, продольный надрез на переднебоковой бедренной кости. Латеральной поверхности бедренной кости затем подвергаются путем разделения широкая мышца бедра латеральнойи двуглавой мышцы бедра мышцы. Рисунок 3. Фиксация на бедренной сегментных дефектов (ФУР) творчества. Полиэтилен пластиной (длина 23 мм, ширина 4 мм, высота 4 мм) находится на переднебоковой поверхности бедра. Пластина состоит из шести предварительно просверленные отверстия для размещения диаметром 0,9 мм с резьбой провода Киршнер. Принимая пластину в качестве шаблона, шесть резьбовых провода Киршнер бурятся через пластину и так коры. Далее, на 6 мм в середине диафизарных дефектов создается. Как только это будет выполнено, заказные леса напрямую вставляется который точно соответствует дефект сайта (не показано). Рисунок 4. Пример свода дефект послеоперационной. 4 мм, круговой дефект свода создается в правой теменной кости в бестимусных мышей. Отображаемого здесь дефект сайт имплантировалиЭСК на 8 недель послеоперационного. Обратите внимание на наличие новой кости в дефект сайта.