Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

1. Perivaskuläre Stammzellisolation Dies wird in Einzelheiten in der nebenstehenden Artikel "Die Reinigung von Perivaskuläre Stammzellen aus menschlichen weißen Fettgewebe" beschrieben, vertreten durch M. CORSELLI et al. 2. Scaffold Creation Gerüste sind an zuvor veröffentlichten Protokolls aus Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA, Burmingham Polymer) mit Hydroxyapatit-Beschichtung 4-6 Maß. Apatit-beschichteten PLGA Gerüste werden von 85/15 PLGA im Gießverfahren und einem teilchenförmigen Laugung hergestellt. Gerüste sind in einer sphärischen Form (2 mm Durchmesser) für Muskel Beutel Implantation, eine Scheibenform (4 mm Durchmesser) für Calvaria Implantation oder zylindrische (4 mm Durchmesser, 6 mm Länge) für femorale Segmentdefekten erstellt. Kurz gesagt, PLGA / Chloroform-Lösungen mit Saccharose (Polymer / Saccharose-Verhältnis 5/95, w / w) gemischt werden, in einen 200-300-Mikrometer Durchmesser Teflonform, um die maßgeschneiderte Nachteile schaffen gegossentruct. Nach dem Gefriertrocknen über Nacht werden die Gerüste aus Teflon-Form entfernt und in ddH 2 O, um die Saccharose zu lösen. Gerüste werden durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 min desinfiziert, gefolgt von drei Spülungen ddH 2 O. Für Apatit-Beschichtung wird ein simulierter Körperflüssigkeit (SBF) Lösung durch sequentielles Lösen von CaCl 2, MgCl 2 • 6H 2 O, NaHCO 3 und K 2 HPO 4 • 3 H 2 O in ddH 2 O. vorbereitet Lösung auf pH 6 mit indem 1 M Salzsäure zur Erhöhung der Löslichkeit verringert. Na 2 SO 4, KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,5 (SBF 1) eingestellt. Mg2 + und HCO 3 – frei SBF (SBF 2) wird durch Zugabe von CaCl 2 und K 2 HPO 4 • 3 H 2 O in ddH 2 O und pH-Wert auf 6 gesenkt vorbereitet. KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,8 eingestellt. Alle Lösungen sind steril durch eine 0,22 um PES Membr gefiltertane (Nalgene). Unmittelbar vor dem Beschichten werden die getrockneten PLGA Gerüsten Glimmentladung Argon-Plasma-Ätzen (Harrick Scientific) unterzogen, um die Benetzung und Beschichtungsgleichmäßigkeit zu verbessern. Geätzte Gerüste werden dann in SBF 1 für 12 h inkubiert und geändert werden, um Mg 2 + und HCO 3 – freien SBF 2 für weitere 12 h bei 37 ° C unter leichtem Rühren. Beschichtete Gerüste werden mit ddH 2 O gewaschen, um überschüssige Ionen zu entfernen und lyophilisiert vor der weiteren Untersuchungen. 3. Das Muscle Pouch Modell Implantation 100 ul einer PSC-Suspension in PBS (Phosphate Buffered Saline) werden vorsichtig auf die sphärische PLGA-basierte Implantat unmittelbar vor der Implantation gesunken. Die Zellen wurden durch lentiviralen Einsetzen der Firefly-Luciferase voretikettiert, um in vivo nach der Implantation Tracking zu ermöglichen. Die Zelldichte von 2,5 x 10 5 pro Implantat. SCID (severe combined immundefizienten) Mäuse werden am Alter von 6 Wochen eingesetzt. Die Tiere sind Anesthetized durch Einatmen und Isofluran Prämedikation mit Buprenorphin (Bedford Labs). Nach dem Standard-Betadin Herstellung werden die bilateralen Einschnitte in den hinteren Gliedmaßen aus (Längs-und 2 mm in der Länge). Taschen sind in den Bizeps femoris durch stumpfe Präparation parallel zur Muskelfaser langen Achse geschnitten. Für jede Maus, wird das PLGA-basierte Implantat mit PSCs eingeführt und der Faszie des Muskels mit 5-0 Vicryl (Ethicon) vernäht. Die Haut wird mit 5-0 Vicryl nächste in einer subkutanen Muster geschlossen. Für 10 Tage; Tiere sind postoperativ mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX (Qualitest Trimethoprim / Sulfamethoxazol) behandelt. 4. Die Schädeldecken Defektmodell Implantation Nach Isofluran-Narkose von SCID-Mäusen (12-14 Wochen alt), wird das Haar geschoren und die Haut mit Betadine pro Protokoll desinfiziert. Ein 8-mm Hautschnitt entlang der Mitte Pfeilnaht der Maus Kalotte hat. Als nächstes wird die calvArial Periost wird sanft von Q-Tip-Anwendung entfernt. Dann wurde unter Verwendung diamantbeschichteten Trephine Bits in einem Breitband-Dentalbohrers wird ein 4-mm-parietalen Knochendefekt erstellt. Der Defekt ist voller Stärke – aber nicht darauf geachtet wird, um die darunterliegende Dura mater zu verletzen. Der maßgefertigte PLGA-basierte Implantat mit eingepflanzten PSCs wird dann vorsichtig in der defekten Stelle platziert. Die Zelldichte von 2,5 x 10 5 pro Implantat. Schließlich wird die Haut mit 6-0 Vicryl vernäht. Die Tiere werden nach der Operation mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX für 10 Tage behandelt. 5. Der Femur segmentalen Defekt Modell Implantation Athymischen Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und zubereitete pro Standard-Protokoll mit Betadine (Abbildung 1). Ein 27-30-mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Der Femurschaft wird dann durch die Trennung der vastus lat. ausgesetzteralis und M. biceps femoris (Abbildung 2). Um die Konsistenz der Knochenregeneration zu maximieren, wird das Periost über der femoralen Defekt vollständig mit der resezierten femoralen Segment entfernt. Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte (Zimmer) unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales (Abbildung 3) niedergebracht. Als nächstes wird mit einer kleinen oszillierenden Sägeblatt (Stryker, MI) wird eine 6-mm-Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Segment Defekte werden dann durch die Insertion von PLGA Implantaten auf die beladen worden mit Zellen gemäß Protokoll (4) behandelt wurden. Die darüber liegende Muskeln und Faszien sind mit 4-0 Vicryl resorbierbaren Fäden verschlossen, um das Implantat zu fixieren, und die Haut vernäht. </li> 6. In-vivo-Beurteilungen Radiographische Bewertungen sind in einer Längsrichtung Weise sowohl Hochauflösung XR und Hochauflösung μCT (Mikro-Computertomographie)-Analyse durchgeführt. Für μCT-Analyse (Skyscan 1172F), werden die Bilder bei einer Auflösung von 19,73 um (100 kV und 100 mA Strahlungsquelle mit Hilfe eines 0,5 mm Aluminium-Filter) gescannt. Bilder werden mit Hilfe DataViewer, Recon, CTAN, und CTVol Software. Biolumineszenz-Bildgebung wird auch in serieller Weise zu Zelle Transplantation, Lebensfähigkeit, der Vermehrung zu beurteilen und schließt Migration aus der Implantationsstelle getan. Biolumineszenz-Bildgebung erfolgt mit Hilfe eines IVIS Lumina II Gerät (Caliper Life Sciences). Licht-Ausgänge werden quantifiziert durch lebende Image Software (Xenogen). Insgesamt Lichtleistung wird in Photonen / Sekunde / cm ² / Steradiant aufgezeichnet. Histologische und histomorphometrische Analyse wird post mortem durchgeführt. Routinefärbungen eingesetzt werden, umfassen Masson, Anilinblau, S.entachrome und Picrosirius rot. Histomorphometrische Analyse lässt sich leicht entweder mit Anilinblau oder pentachrome Flecken durchgeführt, bei dem Osteoid dunkelblau und gelb, bzw. erscheint. Pixel pro starkem Gesichtsfeld berechnet mit dem Zauberstab-Werkzeug in Adobe Photoshop. 7. Repräsentative Ergebnisse Da sowohl die Schädeldecken und femoralen Defekte kritischen Größe sind, sollten keine signifikante Heilung ohne Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder exogene Stammzellen zu erwarten. In Bezug auf die chirurgische Manöver sollte der Muskel Beutel Dissektion entlang Faszien sein und damit minimale Blutung sollte begegnet werden. Auch wenn der Muskel Beutel Modell bilateraler Ebene durchgeführt wird, sollte die Maus mit Leichtigkeit am Tag nach der Operation ein zu Fuß. Für die Kalvariamodell Defekt wird Blutungen auftreten, kann aber mit einem Wattestäbchen getränkt werden. Äußerste Sorgfalt sollte nicht auf die zugrunde liegende Dura mater verletzt werden – wie dies störenmit normaler Heilung. Für die FSD-Modell wird darauf geachtet, nicht um die großen Blutgefäße zu verletzen, so wie nicht übermäßige Blutungen oder den N. femoralis zu veranlassen, um neurologische Schäden zu verhindern. Kirschner-Drähte mit leichtem Druck gebohrt, um nicht den kortikalen Knochen in dem Verfahren beschädigt werden. Abbildung 1. Präoperative Vorbereitung für Femur segmentalen Defekt (FSD) in athymischen Ratten. Männliche Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und desinfiziert pro Standard-Protokoll mit Betadine. Abbildung 2. Operative Freilegung für Femur segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein 27-30 mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Die lateralen Seite des Femurs wird dann durch Trennen des Musculus vastus lateralis ausgesetztund M. biceps femoris. Abbildung 3. Fixierung für Femoral segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales gebohrt. Als nächstes wird eine 6 mm Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Sobald dies durchgeführt wird, wird eine maßgeschneiderte Gerüst direkt eingefügt, die genau den Defekt vor Ort (nicht dargestellt). Abbildung 4. Beispiel für Kalvariamodell Defect Postoperative. Ein 4 mm, kreisförmigen Calvaria Defekt in der rechten Scheitelbein in athymischen Mäusen erzeugt. Abgebildeten hier ist ein Defekt implantiert mitPSCs nach 8 Wochen postoperativ. Notieren Sie sich die Anwesenheit des neuen Knochens innerhalb der defekten Stelle.