Индукция и тестирование Гипоксия в культуре клеток

1. Гипоксия индуцированных CoCl 2 решения Кобальта (II) хлорид гексагидрат (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237,9) является химического индуктора гипоксия-индуцируемый фактор-1.3 8. Этот продукт растворим в воде (100 мг / мл), что дает ясный, красный раствор. Подготовка 25 мМ маточного раствора в стерильной воде дд, (готовить непосредственно перед употреблением) Используйте CoCl 2 в конечной концентрации 100 мкм в регулярных средах культуре клеток, чтобы вызвать гипоксию. Добавить CoCl 2, содержащих средства массовой информации со своими клетками и инкубировать культур на 24 часов в обычных инкубатор (37 ° С, 5% С0 2). Выше концентрация работает на клеточных линиях, мы проверили, но каждой клеточной линии должны быть проверены в различных концентрациях (установить дозозависимый кривой), а также в разное время инкубации с целью ограничения, связанные с наркотиками токсичности и оптимизации анализа. 2. Гипоксия, индуцированной в модульной инкубатор палаты Подготовка по крайней мере два одинаковых (две культуры) клеточных культурах. Клеточные культуры могут быть в контейнерах, тарелки или культуры блюд. Чтобы открыть камеру, сначала откройте две белые пластиковые зажимы расположены на трубках прилагается к камере (трубы, используемые для инъекций / чистки гипоксических газа) и осторожно откройте зажим стальное кольцо. Отпустите зажим. Крышки и лотки теперь могут быть удалены. Место культуры клеток в гипоксической камере. Также место чашки Петри со стерильной водой в камере обеспечить адекватное увлажнение культур. Место "близнецов" в культуре клеток нормоксии в качестве контроля. Убедитесь, что ваш лотки закреплены и не движется, а затем закройте камеру с крышкой. Правильно положение зажима стальное кольцо для обеспечения герметичной закрытия камеры и закройте его. Чтобы создать гипоксии, приложите трубку к "гипоксия бак", содержащий 1% O 2 газовой смеси. Если у вас есть расходомер, подключенных к вашей камере танк будет иметь прямое отношение к нему (бензобак-расходомер-камеры). Мы используем расходомер включены в наш регулятор. Важно, чтобы удалить большинство, если не весь кислород присутствует в камере и в средствах массовой информации, сделать это флеш камере, открыв бензобак при скорости потока 20 литров в минуту в течение 7-10 минут, затем быстро выключить газа и полностью закрыть камеру, закрывая как белые, так зажимов. Вернуться к камере обычного инкубатор для желаемого периода времени. Если вы используете большой культуры, позволяют средства массовой информации в культур-де-газ в течение 1 – 2 часа, а затем повторить флеш. Выше действия основаны на рекомендациях конструктор »(Биллапс-Ротенберг, Inc). Убедитесь, что вы топливный бак надежно закреплены на все времена. Примечания: В целях устранения O 2, содержащихся в средствах массовой информации рекомендуется повторно газа камере сразу же после 1-3 часа. За время инкубации дольше, чем 48hours это также рекомендуется повторно газе камеры. Кислородные датчики (электроды / манометр), которые позволяют измерения О 2, содержащегося в клетках / камера обеспечит более точное измерение внутриклеточного / камеры O 2 содержат). Культивирование клеток на различных длинах время, чтобы раз-кривой поможет определить оптимальное время выражение HIF-1α в вашей конкретной клетки. 3. Оценка Гипоксия HIF-1 α обнаружения иммуноблоттинга. Снова откройте вашу камеру, как описано в разделе 2.2 и сразу же разместить культур на льду. Lyse гипоксии лечение и необработанными клетками с 5% SDS решение в пластинах затем передать ячейки лизат для труб, разрушать ультразвуком, spindown ячейки мусором и собирать супернатант. Мера концентрации белка использованием BCA комплект, подготовить образец путем добавления буфера загрузки и отопления при температуре 95 ° С в течение 5 мин. Electrophorese белков на 8% SDS-полиакриламидном геле и трансфер в нитроцеллюлозных мембран. Блок мембраны в PBS, содержащем 5% обезжиренного сухого молока и 0,1% Твин-20 при комнатной температуре в течение 1 часа при температуре 4 ° С в течение ночи на шейкере. Вестернблот ночь с анти-HIF-1α первичных моноклональных антител (1 / 600) в том же буфере при 4 ° C. Промыть 3 раза в PBS, содержащем 0,1% Твин-20 при комнатной температуре, 5мин каждый раз, инкубировать с HRP-вторичными антителами (1 / 2000) в PBS + 0,1% Твин-20 в течение 45 мин. Промыть 3 раза в PBS, содержащем 0,1% Твин-20 при комнатной температуре, 5 мин / времени. Используйте Пирс ECL комплект и рентгеновской пленки, чтобы показать белка группы Гипоксия Отзывчивый Element (HRE). HIF-1α регулирует многочисленные гены (например, VEGF, EPO), связываясь с последовательностью называется гипоксия регулирующий элемент (HRE). Использование области прав человека, связанные с маркерный ген ят можно обнаружить HIF деятельности 9. Чтобы использовать этот метод, сначала нужно для трансфекции клеток с вашей HRE-люциферазы плазмиды использованием метода трансфекции адаптированы к вашим клеткам. Например, мы использовали Lipofectamine 2000 года. Клетки должны быть трансфицированных не менее 4 часов, прежде чем быть инкубировали при гипоксии и нормоксии. Это время позволяет ввести ДНК клеток так, чтобы этот первый шаг не зависит от гипоксии. Люциферазы сигнала определяется с помощью люциферазы Kit анализа. Инкубируйте ваш HRE-трансфекции клеток в гипоксии в модульной камеры или использовать HRE-трансфекции клетки инкубировали с CoCl 2, включают контроль нормоксии. После желаемого инкубации удалить питательную среду из клеток. Промыть клеток в PBS, удалить PBS. Внесите 400μl 1X реагента лизис в культуре блюдо и скрести прилагается клеток, а затем передавать их на микро трубки. Гранул мусора краткие центрифугирования. Смешать 20 мкл надосадочной клеточных лизатов с 100 мкл реагента люциферазы Анализ и измерения люминесценции использованием люминометра. 4. Представитель Результаты: В клетках К562 (линии клеток человека лейкемия) культурный 2 дня в странах с низким кислорода, по сравнению с нормоксии, гипоксия вызывает увеличение HIF-1α белок, который был обнаружен иммуноблоттинга (рис. 1). Использование HRE-люциферазы модифицированный 293 клеток (эмбриональные линии клеток почек) культивировали в гипоксией, значительное увеличилось на HIF-1α активность была обнаружена в гипоксических клеток (рис. 2). Рисунок 1: Увеличить HIF-1α в гипоксических клеток. К562 Клетки культуры в нормоксии и гипоксии (гипоксическая камеры) в течение 48 часов и анализируется иммуноблоттинга использованием антител, специфичных для HIF-1α. Антитела, специфичные для актин был использован для управления загрузкой. Figure2: HIF-1α деятельности. HRE-293 люциферазы изменение клетки культивировали в условиях гипоксии и нормоксии в течение 48 часов, а затем разрушается для обнаружения сигнала с помощью люциферазы люциферазы набор анализов и люминометра. Результаты выражаются в относительных единицах свечения (РГ).