細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

1。のCoCl 2ソリューションにより誘発される低酸素症塩化コバルト（II）六水和物（のCoCl 2•6H 2 O、MW = 237.9）は、低酸素誘導因子- 1.3 8の化学誘導物質です。この製品は、透明な、赤色溶液を得た、水（100 mg / ml）を可溶である。 滅菌DDの水に25mMのストック溶液を準備し、（使用直前に準備する） 低酸素症を誘発するために、通常の細胞培養培地中の100μMの最終濃度でのCoCl 2を使用してください。 あなたの細胞へのCoCl 2を含む培地を加え、従来のインキュベーターで24時間のために文化をインキュベート（37℃、5％C0 2）。 上記の濃度は、我々がテストしたが、各細胞株の薬剤関連毒性を制限し、アッセイを最適化するために様々なインキュベーションの時間にだけでなく、種々の濃度（用量依存曲線を確立する）で試験されるべき細胞株に対して機能します。 2。モジュラーインキュベーターチャンバーに誘導される低酸素症少なくとも二つの同一の（ツイン文化）の培養細胞を準備します。細胞培養は、フラスコ、プレートまたは培養皿にすることができます。チャンバーを開くには、最初の部屋に取り付けられたチューブ（注入/低酸素ガスをパージするために使用されるチューブ）にある2つの白色プラスチック製のクランプを開き、ゆっくりとスチールリングクランプを開きます。 クランプを離します。蓋とトレーが削除することができます。 低酸素室での細胞培養を置きます。また、文化の十分な加湿を提供するために、チャンバー内に滅菌水を含むペトリ皿を置きます。 コントロールとして正常酸素状態で"双子"細胞培養を置きます。 あなたのトレイを固定し、動かないし、その蓋とチャンバーを閉じていることを確認してください。正しくチャンバーの気密閉鎖性を確保し、それを閉じるために鋼製リングクランプを配置します。 低酸素症を作成するには、1％O 2ガスの混合物を含む"低酸素タンク"にチューブを取り付けます。あなたのタンクに接続されている流量計を持っていて、チャンバーは、直接（ガスタンク – 流量計 – 室）に接続されます。私たちは、レギュレータに内蔵された流量計を使用してください。 それは大部分を削除しない場合はチャンバー内で、メディア内のすべての酸素の存在、7-10分間分あたり20リットルの流量でガスのタンクを開いて、チャンバーをフラッシュそうすることが重要です。その後すぐにオフにするガスの流れと完全に白のクランプの両方を閉じることにより、チャンバーを閉じてください。 所望の期間については、従来のインキュベーターにチャンバーを戻す。 2時間とは、flush繰り返す – あなたが大規模な文化を使用する場合は、1の脱ガスへの文化の媒体ができます。 上記の手順は、コンストラクタの勧告"（ビラップス – ローゼンバーグ、株式会社）に基づいています。このガスのタンクが正しく、すべての時点で固定されていることを確認してください。 注意事項： それは1 – 3時間後にチャンバー一度の再ガスにアドバイスされているメディアに含まれるO 2を除去するために。 48時間より長いインキュベーション時間のためにそれはまた、再ガス室することをお勧めします。 O 2の測定値は、セル/チャンバー内に含まれる許容酸素センサ（電極/マノメーター）室/細胞内O 2が含まれる）のより正確な測定を提供します。 時間曲線を作るための様々な時間の長さでの培養細胞は、特定の細胞におけるHIF -1αの最適な時間の表現を決定するに役立つだろう。 3。低酸素の評価 ウェスタンブロットによるHIF – 1αの検出。 セクション2.2で説明されているようにチャンバー再度開いて、すぐに氷上に自分の文化を置きます。 プレートの5％SDS溶液を用いて低酸素処理と非処理細胞を溶解するし、管に超音波処理、スピンダウン細胞の破片をセルlyzateを転送し、上清を収集する。 BCAキットを用いて測定するのタンパク質濃度は、5分間95℃ローディング緩衝液と加熱° Cを追加することで、サンプルを準備する。 8％SDS -ポリアクリルアミドゲルとニトロセルロース膜への転送に関する電気泳動タンパク質。 1時間またはシェーカー上で4℃で一晩、室温で5％脱脂粉乳を含むPBSで細胞膜と0.1％Tween20をブロックする。 4で同緩衝液中の抗HIF -1α一次モノクローナル抗体（1 / 600）で一晩イムノ℃に 45分間、PBS + 0.1％ツイーン20でHRP -二次抗体（1 / 2000）で5分、室温でTween 20を各時間インキュベートを0.1％含有するPBSで3回洗浄する。 PBSで室温、5分/一度にTween20を0.1％で3回洗浄する。 タンパク質バンドを表示するにはピアースECLキットとX線フィルムを使用 低酸素応答配列（HRE）。 HIF -1αは低酸素規制エレメント（HRE）と呼ばれる配列に結合することにより、多数の遺伝子（すなわちVEGF、EPO）を調節する。私は、マーカー遺伝子に関連するHREを使用してtは9 HIFの活性を検出することが可能である。この方法を使用するには、まず、あなたの細胞に適したトランスフェクション法を用いてHRE -ルシフェラーゼプラスミドを使用して細胞をトランスフェクトする必要があります。例えば、我々は、リポフェクトアミン2000を使用。細胞が低酸素症および正常酸素状態でインキュベートする前に、少なくとも4時間をトランスフェクションする必要があります。この時間は、この最初のステップは、低酸素の影響を受けないように、DNAが細胞に侵入することができます。ルシフェラーゼシグナルは、ルシフェラーゼアッセイキットを用いて検出される。 モジュラーチャンバーで低酸素状態でHRE -トランスフェクトした細胞をインキュベートするかのCoCl 2でインキュベートHRE -トランスフェクトされた細胞を使用して、正常酸素コントロールが含まれています。 希望の潜伏期間の後、細胞から増殖培地を取り除く。 PBSで細胞をリンス、PBSを除去。 培養皿に400μl1X溶解試薬を分配し、付着細胞をこすり、その後、マイクロチューブに移す。 短時間の遠心分離によってペレットの破片。 細胞のミックス20μlのは、ルシフェラーゼアッセイ試薬100μlの上清ライセートとルミノメーターを使用して発光を測定する。 4。代表的な結果： K562細胞（ヒト白血病細胞株）で正常酸素と比較して低酸素下で培養した2日間、低酸素症は、ウェスタンブロット（図1）によって検出されたHIF -1αタンパク質の増加を誘発する。 低酸素状態で培養されたHRE – ルシフェラーゼ改変293細胞（胚性腎臓細胞株）、HIF -1αの活性の増加著しいの使用は、低酸素細胞（図2）で検出された。 図1：低酸素細胞でのHIF -1α増加 。 K562細胞は、48時間、正常酸素と低酸素（低酸素室）における文化だったとHIF -1αに特異的な抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。アクチンに特異的な抗体は、ローディングコントロールのために使用されていました。 図2：HIF -1αの活性 。 HRE -ルシフェラーゼ改変293細胞を48時間低酸素状態と酸素正常状態で培養し、ルシフェラーゼアッセイキットおよびルミノメーターを用いてルシフェラーゼシグナルを検出するために溶解させた。結果は相対発光ユニット（RLU）として表現さ​​れています。