Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

1. Hypoxie durch CoCl 2-Lösung induzierte Cobalt (II)-Chlorid Hexahydrat (CoCl 2 • 6 H 2 O, MG = 237,9) ist eine chemische Induktor von Hypoxie-induzierbaren Faktor-1.3 8. Dieses Produkt ist in Wasser löslich (100 mg / ml), wodurch eine klare, rote Lösung. Bereiten Sie eine 25mM Stammlösung in sterilem dd Wasser (unmittelbar vor Gebrauch vorbereitet) Verwenden Sie CoCl 2 in der endgültigen Konzentration von 100 &mgr; in Ihrem normalen Zellkulturmedien auf Hypoxie zu induzieren. Fügen Sie die CoCl 2 mit Medien, um Ihre Zellen und inkubieren Sie die Kulturen für 24 Stunden in einem herkömmlichen Inkubator (37 ° C, 5% C0 2). Die oben genannten Konzentration arbeitet für die Zell-Linien die wir getestet haben aber jede Zelllinie sollte in verschiedenen Konzentrationen (um eine Dosis-abhängige Kurve zu etablieren) getestet sowie auch in unterschiedlichen Inkubationszeiten um Drogenkriminalität Toxizität zu begrenzen und Optimierung der Assays. 2. Hypoxie in Modular Incubator Chamber induzierten Bereiten Sie mindestens zwei identisch (twin Kultur) Zellkulturen. Zellkulturen können in Flaschen, Teller oder Kulturschalen werden. Zum Öffnen der Kammer, öffnen Sie zunächst die beiden weißen Kunststoff-Schellen an den Rohren befestigt, um die Kammer (Rohre für die Injektion / Spülen der hypoxischen Gas) und öffnen Sie vorsichtig den Stahlring Klemme befindet. Lösen Sie die Klemme. Der Deckel und Schalen können nun entfernt werden. Legen Sie die Zellkultur in der hypoxischen Kammer. Auch Platz eine Petrischale mit sterilem Wasser in die Kammer eine ausreichende Befeuchtung der Kulturen. Platzieren Sie den "Zwilling" der Zellkultur in Normoxie als Kontrolle. Stellen Sie sicher, Schalen befestigt sind und sich nicht bewegt, und schließen Sie dann die Kammer mit dem Deckel. Richtig zu positionieren den Stahlring Haken, um den hermetischen Verschluss der Kammer zu gewährleisten und zu schließen. So erstellen Sie eine Hypoxie, bringen Sie den Schlauch mit einer "Hypoxie-Tank" mit einer 1% O 2-Gasgemisch. Wenn Sie ein Durchflussmesser angeschlossen, um den Tank Ihre Kammer wird direkt an ihn (Gas-Tank-Flow-Meter-Kammer) angeschlossen werden. Wir verwenden ein Durchflussmesser in unserem Regler eingebaut. Es ist wichtig, die meisten zu entfernen, wenn nicht alle vorhandenen Sauerstoff in die Kammer und in Ihren Medien, dies zu tun bündig die Kammer durch Öffnen des Gas-Tank mit einer Flussrate von 20 Litern pro Minute für 7-10 Minuten, dann schnell schalten Sie die Gasfluss und vollständig schließen die Kammer durch Schließen sowohl weiße Klammern. Return der Kammer zu einer herkömmlichen Inkubator für den gewünschten Zeitraum. Wenn Sie große Kulturen verwendet werden, können Medien in den Kulturen zu de-Gas für 1 bis 2 Stunden und wiederholen Sie dann die Spülung. Die oben genannten Schritte sind auf den Konstruktor Empfehlungen "(Billups-Rothenberg, Inc) basiert. Stellen Sie sicher, Gas-Tank ordnungsgemäß zu jeder Zeit gesichert. Notes: Um die O 2 in den Medien enthalten sie wieder Gas geraten ist die Kammer wieder nach 1-3 Stunden zu beseitigen. Für Inkubationszeit länger als 48 Stunden ist es auch wieder Gas in die Kammer beraten. Oxygen Sensoren (Elektroden / Manometer), dass Messungen des O 2 in Zellen / Kammer enthaltene ermöglichen wird eine genauere Messung der intrazellulären / Kammer O 2 enthalten). Kultivieren von Zellen in verschiedenen Zeitspannen zu einem Zeit-Kurve machen würde helfen, die optimale Zeit Expression von HIF-1α in Ihren Zellen. 3. Evaluation von Hypoxie HIF-1 α-Erkennung mittels Western Blot. Re-open deine Kammer, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben und sofort platzieren Sie Ihre Kulturen auf Eis. Lyse Hypoxie behandelten und nicht behandelten Zellen mit 5% SDS-Lösung in die Platten übertragen Sie dann die Zelllysat zu Rohren, beschallen, spindown die Zelltrümmer und den Überstand. Messen Proteinkonzentration mit BCA-Kit, bereiten Probe durch Zugabe von Ladepuffer und Erhitzen auf 95 ° C für 5 min. Elektrophorese Proteine ​​auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel und Transfer auf Nitrozellulose-Membranen. Blockieren Sie die Membran in PBS mit 5% fettfreier Trockenmilch und 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht auf Schüttler. Immunoblot Übernachtung mit anti-HIF-1α primären monoklonalen Antikörper (1 / 600) im gleichen Puffer bei 4 ° C. Wash 3 mal in PBS mit 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur 5min jeder Zeit und inkubieren mit HRP-Sekundärantikörper (1 / 2000) in PBS + 0,1% Tween 20 für 45 min. Wash 3 mal in PBS mit 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur 5min / Zeit. Verwenden Sie Pierce ECL-Kit und Röntgenfilm auf die Protein-Bande zeigen Hypoxie Responsive Element (HRE). HIF-1α reguliert zahlreiche Gene (dh VEGF, EPO) durch die Bindung an eine Sequenz namens Hypoxie regulierendes Element (HRE). Mit HRE verbunden mit einem Marker-Gen it ist möglich, HIF Aktivität 9 zu erkennen. Um diese Methode verwenden, müssen Sie zuerst Ihre Zellen mit einem HRE-Luciferase-Plasmid mit einem Transfektionsmethode angepasst an Ihre Zellen zu transfizieren. Zum Beispiel haben wir genutzt Lipofectamine 2000. Zellen benötigen, um transfizierte mindestens 4 Stunden vor dem in Hypoxie und Normoxie inkubiert werden. Dieses Mal kann die DNA in die Zellen eindringen, so dass dieser erste Schritt ist nicht durch Hypoxie beeinflusst. Die Luciferase-Signal erkannt wird mit Hilfe eines Luciferase Assay Kit. Inkubieren Sie HRE-transfizierten Zellen in Hypoxie in modularen Kammer oder benutzen HRE-transfizierten Zellen mit CoCl 2 inkubiert, eine Normoxie Kontrolle. Nachdem die gewünschte Inkubationszeit entfernen Wachstumsmedium von den Zellen. Rinse-Zellen in PBS, entfernen Sie die PBS. Dispense 400μl 1X Lyse-Reagenz in Kulturschale und kratzen die anhaftenden Zellen, übertragen sie dann auf eine Mikro-Schlauch. Pellet Schmutz durch kurze Zentrifugation. Mix 20 &mgr; l der Zelllysate Überstand mit 100 &mgr; l des Luciferase Assay Reagent und messen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer. 4. Repräsentative Ergebnisse: In K562-Zellen (humane Leukämie-Zelllinie) kultiviert 2 Tage in geringem Sauerstoffgehalt, im Vergleich zu Normoxie, Hypoxie induziert eine Erhöhung der HIF-1α Protein, das durch Western-Blot (Abbildung 1) erkannt wurde. Mit HRE-Luciferase modifizierten 293-Zellen (embryonale Nieren-Zelllinie) kultiviert in Hypoxie eine signifikante erhöht wurde von HIF-1α Aktivität in hypoxischen Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 2). Abbildung 1: Zunahme HIF-1α in hypoxischen Zellen. K562-Zellen wurden in Kultur Normoxie und Hypoxie (Hypoxie-Kammer) für 48 Stunden und analysiert durch Western-Blot mit einem Antikörper, der spezifisch für die HIF-1α. Ein Antikörper, der spezifisch für Aktin wurde für die Be-Kontrolle eingesetzt. Abbildung 2: HIF-1α Aktivität. HRE-Luciferase modifizierten 293-Zellen in Hypoxie und Normoxie für 48 Stunden kultiviert und anschließend lysiert, um Luciferase-Signal mit Hilfe eines Luciferase-Assay-Kit und einem Luminometer zu erkennen. Die Ergebnisse werden als relative Lumineszenz-Einheit (RLU) angegeben.