Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

1. La hipoxia inducida por CoCl 2 solución Cobalto (II) hexahidratado Cloruro (CoCl 2 • 6H 2 O, PM = 237,9) es un inductor químico del factor inducible por hipoxia 1,3 8. Este producto es soluble en agua (100 mg / ml), dando una solución clara, de color rojo. Prepare una solución madre 25 mM en agua estéril dd, (prepararse inmediatamente antes de su uso) Use CoCl 2 en la concentración final de 100μM en sus medios regulares de cultivo de células para inducir la hipoxia. Agregue el CoCl 2 medios que contienen a las células y se incuban los cultivos durante 24 horas en una incubadora convencional (37 ° C, 5% C0 2). A la concentración de obras para las líneas celulares que hemos probado, pero cada línea celular debe ser probado en diferentes concentraciones (para establecer una curva dosis-dependiente), así como en diversos tiempos de incubación con el fin de limitar la toxicidad relacionada con las drogas y optimizar el ensayo. 2. Hipoxia inducida en Modular cámara de la incubadora Preparar al menos dos cultivos celulares idénticos (la cultura twin). Los cultivos de células pueden ser en cofres, los platos o la cultura. Para abrir la cámara, abrir por primera vez las dos abrazaderas de plástico blanco se encuentra en los tubos conectados a la cámara (tubos utilizados para la inyección / purgar el gas hipóxico) y abra suavemente el anillo de sujeción de acero. Suelte la abrazadera. La tapa y bandejas de ahora se puede quitar. Coloque el cultivo de células en la cámara de hipoxia. También colocar una placa de Petri que contiene agua estéril en la cámara para proporcionar humidificación adecuada de los cultivos. Coloque el "gemelo" de cultivo de células en normoxia como control. Asegúrese de que las bandejas están garantizados y no se mueve, y luego cerrar la cámara con su tapa. Correctamente la posición del anillo de sujeción de acero para garantizar el cierre hermético de la cámara y ciérrelo. Para crear la hipoxia, conectar el tubo a un "tanque de hipoxia", que contiene un 1% O 2 mezcla de gases. Si usted tiene un medidor de flujo conectado al tanque de su cámara se puede conectar directamente a él (el tanque de gas de flujo metros de la cámara). Nosotros utilizamos un medidor de flujo incorporado en nuestro organismo regulador. Es importante para la mayoría, si no eliminar todos los presentes oxígeno en la cámara y en sus medios de comunicación, para hacerlo al ras de la cámara mediante la apertura del tanque de gas con un caudal de 20 litros por minuto durante 7-10 minutos, y luego rápidamente apagar el flujo de gas y se cierra completamente la cámara mediante el cierre de dos pinzas blancas. Devolver la cámara a una incubadora convencional para el período de tiempo deseado. Si utiliza grandes culturas, que el material de las culturas de gas de 1 a 2 horas y luego repetir color. Los pasos anteriores se basan en las recomendaciones constructor '(Billups-Rothenberg, Inc). Asegúrese de que el tanque de gas se fijan correctamente en todo momento. Notas: Con el fin de eliminar el O 2 contenido en los medios de comunicación, se aconseja volver a la cámara de gas una vez después de 3 horas 1. Para el tiempo de incubación más largo que 48 horas también se recomienda a la cámara de re-gas. Los sensores de oxígeno (electrodos / manómetro) que permiten la medición de la O 2 contenido en células / cámara proporcionará una medición más precisa de la O intracelular / cámara de 2 contienen). El cultivo de células en diferentes longitudes de tiempo para hacer una curva de tiempo-podría ayudar a determinar el momento óptimo de expresión de HIF-1α en células específicas. 3. Evaluación de la hipoxia HIF-1 α detección por Western blot. Volver a abrir su cámara como se describe en la sección 2.2 e inmediatamente colocar sus cultivos en el hielo. Lisis de la hipoxia células tratadas y no tratadas con 5% de solución de SDS en las placas luego transferir el lyzate celular a los tubos, ultrasonidos, spindown los restos celulares y recoger el sobrenadante. Mediciones de concentración de proteínas utilizando BCA kit, preparar la muestra mediante la adición de tampón de carga y la calefacción a 95 º C durante 5 min. Electroforesis de proteínas en un 8% SDS-gel de poliacrilamida y la transferencia a membranas de nitrocelulosa. Bloquear la membrana en PBS que contenía 5% sin grasa leche en polvo y 0,1% Tween 20 a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche en la coctelera. Durante la noche con anti-HIF-1α anticuerpo monoclonal primario (1 / 600) en el mismo buffer inmunoblot a 4 ° C. Lavar 3 veces en PBS que contenía 0,1% de Tween 20 a temperatura ambiente, 5 minutos cada vez y se incuban con HRP-secundaria de anticuerpos (1 / 2000) en PBS + 0,1% Tween 20 durante 45 minutos. Lavar 3 veces en PBS que contenía 0,1% de Tween 20 a temperatura ambiente, 5 minutos / hora. Use Pierce ECL kit y películas de rayos X para mostrar la banda de la proteína Elemento Sensible hipoxia (HRE). HIF-1α regula numerosos genes (es decir, VEGF, OEP), mediante la unión a una secuencia denominada Elemento de Regulación de hipoxia (HRE). Educación en derechos humanos asociados al uso de un gen marcador it es posible detectar la actividad de HIF 9. Para utilizar este método, primero que hay que transfectar las células con un plásmido de luciferasa HRE mediante un método de transfección adaptado a las células. Por ejemplo, podemos utilizar Lipofectamine 2000. Las células necesitan para ser transfectadas por lo menos 4 horas antes de ser incubados en hipoxia y normoxia. Este tiempo permite que el ADN de entrar en las células de modo que este primer paso no se ve afectada por la hipoxia. La señal de luciferasa se detectó mediante un Kit de ensayo de luciferasa. Incubar la educación en derechos humanos, las células transfectadas en la hipoxia en la cámara modular o el uso de EDH-transfectadas las células se incubaron con CoCl 2, incluir un control de normoxia. Después del período de incubación se desea, eliminar el medio de cultivo de las células. Enjuague las células en PBS, retire la PBS. Dispensar 400μl del reactivo de lisis 1X en placa de cultivo y raspar las células adheridas, y luego los transferirá a un tubo de micro. Pellet los escombros por centrifugación breve. 20μl mezcla de lisados ​​celulares sobrenadante con 100μl del reactivo de ensayo de luciferasa y medir la luminiscencia usando un luminómetro. 4. Los resultados representativos: En las células K562 (línea de células humanas de leucemia) cultivadas en dos días con poco oxígeno, en comparación con normoxia, la hipoxia induce un aumento de HIF-1α proteína que se detectó por Western blot (Figura 1). Utilizando HRE-luciferasa modificados células 293 (línea de células embrionarias de riñón) se cultivan en la hipoxia, un significativo aumento de HIF-1α se detectó actividad en las células hipóxicas (Figura 2). Figura 1: Aumento de HIF-1α en células hipóxicas. K562 células fueron la cultura en normoxia e hipoxia (cámara de hipoxia) durante 48 horas y se analizaron por Western blot utilizando un anticuerpo específico para HIF-1α. Un anticuerpo específico para la actina se utilizó para el control de carga. Figura 2: HIF-1α actividad. Educación en derechos humanos-luciferasa modificados 293 células fueron cultivadas en hipoxia y normoxia durante 48 horas y luego se lisaron para detectar la señal de luciferasa utilizando un kit de ensayo de luciferasa y un luminómetro. Los resultados se expresan como la unidad de luminiscencia relativa (RLU).