Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

1. Hipóxia induzida por solução de 2 CoCl Cloreto de cobalto hexa-hidratado (II) (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237,9) é um indutor químico da hipóxia induzida por fator de 1,3 8. Este produto é solúvel em água (100 mg / ml), produzindo uma solução clara e vermelho. Prepare uma solução estoque 25 mM em água dd estéril, (preparar imediatamente antes do uso) Use CoCl 2 na concentração final de 100μM em seus meios de cultura de células regulares para induzir hipóxia. Adicione o CoCl 2 mídia contendo as suas células e incubar as culturas de 24 horas em uma incubadora convencional (37 ° C, 5% C0 2). A concentração acima funciona para as linhas de células que temos testado, mas cada linha celular deve ser testado em várias concentrações (para estabelecer uma curva dose-dependente), bem como em vários tempos de incubação, a fim de limitar a toxicidade relacionada com a droga e otimizar o ensaio. 2. Hipóxia induzida em Modular Incubadora Câmara Preparar pelo menos duas culturas de células idênticas (cultura twin). Culturas de células pode ser em barris, pratos ou travessas cultura. Para abrir a câmara, abre pela primeira vez as duas braçadeiras de plástico branco localizado na tubos ligados à câmara (tubos utilizados para a injeção / purga do gás hipóxico) e abra cuidadosamente o grampo anel de aço. Solte o grampo. A tampa e bandejas podem agora ser removido. Coloque a cultura de células na câmara hipóxica. Também colocar uma placa de Petri contendo água estéril na câmara para fornecer umidificação adequada das culturas. Coloque a cultura de células "gêmeo" em normóxia como controle. Verifique se o seu bandejas são garantidos e não em movimento, e depois fechar a câmara com a tampa. Posicionar corretamente a braçadeira anel de aço para garantir o fechamento hermético da câmara e fechá-lo. Para criar hipóxia, conectar o tubo a um "tanque de hipóxia", contendo a 1% da mistura de gases O 2. Se você tiver um medidor de fluxo conectado ao seu tanque de sua câmara estará diretamente conectado a ele (gás tanque de fluxo metros-câmara). Usamos um medidor de fluxo incorporadas em nosso regulador. É importante remover a maior parte se não estiver presente todo o oxigênio na câmara e em seus meios, para fazê-lo lavar a câmara através da abertura do tanque de gás a uma vazão de 20 litros por minuto por 7-10 minutos, em seguida, desligar rapidamente o fluxo de gás e fechar completamente a câmara, fechando ambos os grampos branco. Retorno da câmara para uma incubadora convencional para o período de tempo desejado. Se você usar grandes culturas, permitem mídia em culturas de-gás para 1-2 horas e depois repetir flush. As etapas acima são baseados nas recomendações do construtor "(Billups-Rothenberg, Inc). Certifique-se de tanque de gás são devidamente protegidas em todos os tempos. Notas: , A fim de eliminar o O 2 contidas na mídia, é aconselhável a re-gás na câmara de uma vez depois de 1-3 horas. Por tempo de incubação mais longo do que 48 horas também é aconselhado a re-câmara do gás. Sensores de oxigênio (eletrodos / manômetro) que permitem medições do O 2 contidos em células / câmara irá proporcionar uma medição mais precisa do O intracelular / câmara de 2 contêm). A cultura de células em intervalos de tempo diferentes para fazer uma curva de tempo-seria ajudar a determinar a expressão de tempo ideal de HIF-1α em suas células particular. 3. Avaliação de hipóxia HIF-1 de detecção de α por western blot. Reabrir a sua câmara como descrito na seção 2.2 e colocar imediatamente suas culturas no gelo. Lyse hipóxia células tratadas e não-tratados com 5% de solução SDS nas placas, em seguida, transferir o lyzate célula para tubos, sonicate, spindown os restos celulares e recolher o sobrenadante. Concentração medida de proteína usando kit BCA, prepare amostra pela adição de tampão de carregamento e aquecimento a 95 ° C por 5 min. Electroforese de proteínas em um gel SDS 8% de poliacrilamida e transferência para membranas de nitrocelulose. Bloquear a membrana em PBS contendo 5% de leite sem gordura seco e 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite em shaker. Immunoblot durante a noite com anti-HIF-1α anticorpo primário monoclonal (1 / 600) no mesmo tampão a 4 ° C. Lavar 3 vezes em PBS contendo 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente, 5min de cada vez e incube com HRP-anticorpo secundário (1 / 2000) em PBS + 0,1% Tween 20 por 45 min. Lavar 3 vezes em PBS contendo 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente, 5min / hora. Use Pierce kit ECL e X-ray filme para mostrar a banda de proteína Elemento Responsive hipóxia (HRE). HIF-1α regula numerosos genes (ou seja, VEGF, EPO) por ligação a uma seqüência chamada elemento regulador hipóxia (HRE). Usando HRE associado a um gene marcador it é possível detectar atividade de HIF 9. Para utilizar este método, primeiro você precisa transfectar suas células com um plasmídeo HRE-luciferase usando um método de transfecção adaptado às suas células. Por exemplo usamos Lipofectamine 2000. Células precisam ser transfectadas pelo menos 4 horas antes de ser incubadas em hipóxia e normóxia. Desta vez, permite que o DNA para entrar nas células, para que este primeiro passo não é afetada pela hipóxia. O sinal de luciferase é detectada através de um kit de ensaio de luciferase. Incubar a sua HRE-transfectadas células em hipóxia na câmara modular ou usar HRE-transfectadas células incubadas com CoCl 2, incluem um controle normóxia. Após o período de incubação desejado, remova o meio de crescimento das células. Enxágüe células em PBS, remova o PBS. Dispense 400μl do reagente de lise 1X em placa de cultura e raspar as células em anexo, depois transferi-los para um tubo de micro. Pellet detritos por centrifugação breve. 20μl mistura de células lisados ​​sobrenadante com 100μl de reagente de ensaio de luciferase e medir a luminescência com um luminômetro. 4. Resultados representativos: Em células K562 (linha de células humanas de leucemia) cultivados dois dias em baixa de oxigênio, comparado à normóxia, hipóxia induz um aumento do HIF-1α proteína que foi detectada por western blot (Figura 1). Usando HRE-luciferase modificado 293 células (linhagem de células embrionárias de rins) cultivados em hipóxia, um aumento significativo de HIF-1α atividade foi detectada em células hipóxicas (Figura 2). Figura 1: Aumente o HIF-1α em células hipóxicas. K562 células foram cultura em normóxia e hipóxia (câmara hipóxica) por 48 horas e analisadas por western blot usando um anticorpo específico para o HIF-1α. Um anticorpo específico para actina foi usado para o controle de carga. Figura 2: HIF-1α atividade. HRE-luciferase modificado 293 células foram cultivadas em hipóxia e normóxia durante 48 horas e, em seguida, lisados ​​para detectar o sinal luciferase usando um kit de ensaio de luciferase e um luminómetro. Os resultados são expressos como a unidade de luminescência relativa (RLU).