אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא
Summary
כאן אנו מציעים שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים ו בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תרבויות.
Abstract
היפוקסיה מוגדרת הפחתה או חוסר חמצן איברים, רקמות, או תאים. זו ירידה של מתח החמצן יכול להיות בשל אספקת חמצן מופחת (סיבות כוללות כלי דם מספקת הרשת, כלי דם פגומים, ואנמיה) או לצריכה מוגברת של חמצן ביחס לאספקת (הנגרם על ידי קצב התפשטות פתאומית גבוהה התא) . היפוקסיה יכול להיות פיזיולוגי או פתולוגי כגון סרטן מוצק 1-3, וכו 'שגרונית, דלקת פרקים טרשת עורקים … כל רקמות ותאים יש יכולת שונה להסתגל למצב החדש הזה. במהלך היפוקסיה, גורם היפוקסיה ועין מתנהלת אלפא (HIF) הוא התייצב מסדיר גנים שונים כגון המעורבים אנגיוגנזה או הובלה של חמצן 4. ההתייצבות של חלבון זה הוא סימן ההיכר של היפוקסיה, ולכן גילוי HIF משמש באופן שגרתי למסך עבור 5-7 היפוקסיה.
במאמר זה, אנו מציעים שתי שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים יונקים בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תאים אלה.
Protocol
Discussion
התפשטות תאים הכדאיות בתנאים hypoxic להשתנות הרבה בהתאם לסוגי תאים. לכן, כדאי להתאים את מספר הנייד או מספר צלחות תרבויות אתה מתחיל עם לוודא יהיה לך מספיק תאים / חלבונים עבור הניסויים שלך.
השיטה קובלט כלוריד יש את היתרון להיות זול ומהיר. מוצר זה מחקה היפוקסיה ידי גרימת HIF-1/3α אך ניתן גם להסדיר גנים אחרים, יש לוודא כי מוצר זה להתאים את הפרוייקט על ידי בדיקת מה תופעות אחרות זה היה יכול להיות על התפקוד ואת הפנוטיפ של תאים מסוימים באופן עצמאי של "לחקות- אפקט hypoxic ". עוד תרופה המשמשת גם לחקות היפוקסיה היא mesylate Deferoxamine (DFO, השתמשו בריכוז 100 מיקרומטר הסופי). השימוש בתרופות אלה מאפשר experimentator כדי לפתוח את צלחת תרבות / תבשיל / בקבוקון פעמים רבות מבלי להשפיע על "מצב hypoxic".
רמת החמצן הכלול תערובת הגז יכול להשתנות בהתאם הניסויים שלך סוגי תאים כערכים היפוקסיה להשתנות בהתאם הרקמות סוגי תאים. ואכן, תאים מסוימים hypoxic ב 5% O 2 צריך אחרים פחות מ 1% O 2 להיות hypoxic. 5% CO 2 הוא הוסיף תערובת הגז כדי לייצב את pH של התרבויות, שאר הגז הוא בדרך כלל חנקן.
לתאי hypoxic יש את היתרון של שימוש בסמים לא יכול חלופי התנהגות התא עצמאי של מתח החמצן. עם זאת, לא כל סוגי ניסויים אפשר לעשות כמו חמצן החוזרת בפתיחת כל תא ובכך מפחית היפוקסיה. אתה צריך לשקול גורם זה בניסויים שלך; היפוקסיה / מחדש חמצון הוא מצב ספציפי אשר יכולים להשפיע על כמה סוגי תאים. חלופה היא להשתמש בתחנות עבודה היפוקסיה (מחובר טרום מעורבת בלוני גז או למערכות גז ערבוב) או היפוקסיה אינקובטור גדול (תא עיבוד היפוקסיה עם תא הכפפות) המאפשר ניסויים לשנות את התקשורת ולטפל תאים בסביבה hypoxic רציפה. לתאי hypoxic שונים כבר ממוסחר בעשור האחרון ו צריכים להיבחר על פי המעבדה שלך בשימוש, פרויקטים, מרחב, גודל התקציב. תמיד להבטיח את השימוש במצב טוב של החדר שלך כדי להבטיח את התנאים תרבות נכונה. באופן כללי בעת שימוש קאמרית, רמת היפוקסיה יכול להיות מווסתת על ידי בחירת תערובות גזים שונות (כלומר 1%, 5% -10% חמצן).
לגבי זיהוי של HIF-1α, חשוב לדעת כי חלק קו תאים סרטניים לבטא HIF-1α ב normoxia. לכן זה קריטי להשתמש normoxia שליטה לקבוע את רמת הבסיס של HIF אלה שורות תאים. HIF-1α יכול גם להיות נוכח normoxia שאינם תאים ממאירים הבאים גירוי התא או מתח. זה יכול להתרחש גם אם תאים אלה הם מורעבים, ודא בתרביות תאים שלך כמו שצריך להאכיל ומתוחזק.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma | C8661-25G |
| Incubator Chamber | Billups-rothenberg | MIC-101 |
| HRE-Luciferase plasmid | Adgene | Plasmid 26731 |
References
- Swinson, D. E., O’Byrne, K. J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).
- van Laarhoven, H. W. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).
- Hockel, M. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).
- Semenza, G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).
- Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
- Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).
