التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية
Summary
هنا نقترح أساليب بسيطة للحث على نقص الأكسجين في مزارع الخلايا واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين من الثقافات.
Abstract
يتم تعريف نقص الأكسجة بأنه انخفاض أو نقص الأكسجين في الأجهزة والأنسجة أو الخلايا. وهذا يمكن تخفيف حدة التوتر الأكسجين يكون راجعا إلى انخفاض حجم المعروض في الأكسجين (تشمل الأسباب غير كافية شبكة الأوعية الدموية ، خلل الأوعية الدموية ، وفقر الدم) أو إلى زيادة استهلاك الأكسجين النسبي لتوريد (الناجمة عن ارتفاع معدل الانتشار المفاجئ الخلية) . يمكن أن يكون نقص الأكسجين فيزيولوجية أو مرضية مثل سرطانات الصلبة 1-3 ، الخ التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين… كل الأنسجة والخلايا لديها القدرة على التكيف مع مختلف هذه الحالة الجديدة. أثناء نقص الأكسجين ، واستقرت نقص الأكسجين محرض ألفا عامل (مؤسسة الحرمين) ، وينظم جينات مختلفة مثل المتورطين في الأوعية الدموية أو نقل الأوكسجين 4. استقرار هذا البروتين هو السمة المميزة لنقص الأكسجين ، وكشف ذلك يستخدم بشكل روتيني للكشف عن مؤسسة الحرمين 5-7 نقص الأكسجة.
في هذا المقال ، فإننا نقترح طريقتين بسيطة للحث على نقص الأكسجين في خلايا الثدييات الثقافات واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين في هذه الخلايا.
Protocol
Discussion
تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء في ظروف نقص الأوكسجين تختلف كثيرا تبعا للأنواع الخلايا. لذا ، يجب عليك ضبط عدد الخلايا أو عدد من لوحات تبدأ مع الثقافات للتأكد من سيكون لديك ما يكفي من الخلايا / البروتينات لإجراء التجارب الخاصة بك.
كلوريد الكوبالت الأسلوب له ميزة أن تكون غير مكلفة وسريعة. يحاكي هذا المنتج عن طريق حفز HIF-1/3α نقص الأكسجين ولكن يمكن أيضا تنظيم جينات أخرى ، تأكد من تكييف هذا المنتج إلى المشروع الخاص بك عن طريق التحقق من غيرها من الآثار ما كان يمكن أن يكون على وظيفة والنمط الظاهري للخلايا معينة ، بصرف النظر عن تقليد " ميتة "تأثير. دواء آخر يستخدم أيضا لنقص الأكسجين هو تقليد mesylate ديفيروكسامين (DFO ، الذي استخدم في تركيز 100 ميكرومتر النهائي). استخدام هذه العقاقير يسمح experimentator لفتح لوحة الثقافة / صحن / قارورة مرات عديدة دون أن يؤثر ذلك على "حالة نقص الأوكسجين".
لا يمكن للمستوى الأكسجين الموجود في خليط الغاز تختلف تبعا لتجاربك وأنواع الخلايا كقيم نقص الأكسجة تختلف تبعا لأنواع الأنسجة والخلايا. في الواقع ، بعض الخلايا هي ميتة في 5 ٪ O 2 الحاجة الأخرى أقل من 1 ٪ O 2 لتكون ميتة. يتم إضافة 5 ٪ CO 2 إلى خليط الغاز لتحقيق الاستقرار في الرقم الهيدروجيني للثقافات ، والنيتروجين عادة ما تبقى من الغاز.
غرف ميتة لديها ميزة عدم استخدام العقاقير التي يمكن أن سلوك الخلية بشكل مستقل بديل للتوتر الأوكسجين. ومع ذلك ، يمكن القيام به ليست كل أنواع التجريب وإعادة الأوكسجين يدخل غرفة في كل افتتاح ويقلل بالتالي نقص الأكسجين. يجب عليك أن تنظر في هذا العامل تجاربك ؛ نقص الأكسجة / إعادة الأوكسجين هو شرط محدد يمكن أن تؤثر على بعض أنواع الخلايا. بديل لاستخدام محطات العمل نقص الأكسجة (متصلة خزانات الغاز قبل مختلطة أو لأنظمة الغاز الاختلاط) أو أكبر حاضنة نقص الأكسجة (نقص الأكسجة تجهيز الغرفة مع علبة القفازات) التي تسمح للتجريب وسائل الإعلام لتغيير والتلاعب في خلايا ميتة البيئة المستمر. وقد تم تسويقها غرف ميتة مختلفة على مدى العقد الماضي ، وينبغي أن يختار وفقا لاستخدام المختبر الخاص ، والمشاريع ، والفضاء ، والحجم ، والميزانية. ضمان الاستخدام الجيد دائما وحالة الغرفة الخاصة بك لضمان ظروف التربية الصحيحة. بشكل عام عند استخدام الغرفة ، يمكن أن يكون مستوى نقص الأكسجين عن طريق التضمين اختيار يمزج الغاز المختلفة (أي 1 ٪ ، 5 ٪ 10 ٪ أكسجين).
فيما كشف 1α ، مؤسسة الحرمين ، فمن المهم أن نعرف أن بعض الخلايا السرطانية عن خط مؤسسة الحرمين في normoxia – 1α. ومن ثم فهي حاسمة لاستخدام normoxia مراقبة لتحديد المستوى القاعدي لمؤسسة الحرمين في هذه الأسطر الخلية. مؤسسة الحرمين ، ويمكن أيضا أن تكون 1α موجودة في normoxia في غير الخبيثة الخلايا التالية تحفيز الخلية أو الإجهاد. يمكن أن يحدث هذا أيضا إذا تجويع هذه الخلايا ، تأكد من أن يتم بشكل صحيح الثقافات صومعتك الأعلاف والمحافظة عليها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma | C8661-25G |
| Incubator Chamber | Billups-rothenberg | MIC-101 |
| HRE-Luciferase plasmid | Adgene | Plasmid 26731 |
References
- Swinson, D. E., O’Byrne, K. J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).
- van Laarhoven, H. W. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).
- Hockel, M. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).
- Semenza, G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).
- Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
- Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).
