在细胞培养中缺氧诱导和测试

1。缺氧诱导CoCl 2溶液钴（II）氯化（CoCl 2•6H 2 O，分子量= 237.9）是一种化学诱导缺氧诱导因子- 1.3 8。本产品易溶于水（100毫克/毫升），产生一个明确的，红色的解决方案。 准备一个25mm的库存解决方案，在无菌日水（准备使用前） 在常规的细胞培养介质使用CoCl 2诱导缺氧，在终浓度为100μm。 添加CoCl 2包含媒体对你的细胞，并在传统的孵化器孵化24小时的文化（37 ° C，5％C0 2） 。 以上浓度的细胞，我们有测试，但应该是每一个细胞系在不同浓度（建立以剂量依赖曲线）测试以及在不同的孵育时间，以限制药物相关的毒性和优化检测线工程。 2。缺氧诱导模块化孵化厅准备至少有两个相同的（双胞胎文化）的细胞培养。可以在细胞培养瓶，板或培养皿。要打开总商会，首先打开位于室（用于注射吹扫缺氧气/管），轻轻地打开钢圈钳管上的两个白色塑料夹具。 松开夹紧。现在可将盖子和托盘。 将细胞培养在缺氧室。同时置于培养皿中，包含在会议厅内的无菌水，以提供足够的文化加湿。 放置在常氧的“双胞胎”细胞培养作为对照。 确保您的食品是安全的和不动，然后关闭盒盖室。正确定位钢圈夹，以确保密闭的腔封闭，并关闭它。 要创建缺氧，管“缺氧罐”，含有1％O 2的混合气体。如果你有一个连接到你的坦克流量计，你的商会将直接连接到它（煤气罐流量计室）。我们使用在我们的稳压器中的流量计。 重要的是去除大部分并非所有在您的媒体室和氧气目前，这样做，打开煤气罐在7-10分钟每分钟20公升的流量冲洗室;然后迅速关闭气体流量，并完全关闭，关闭两个白色夹子的室。 所需的时间内返回会议厅，一个传统的孵化器。如果使用大型的文化，允许在媒体文化DE气体1 – 2小时，然后重复冲洗。 上述步骤的基础上构造函数的建议“（比卢普斯罗森堡，INC）。确保你煤气罐在所有的时间获得正确。 注： 为了消除媒体中的O 2，建议将重瓦斯后1 -3小时室一次。 孵化时间较长比48小时它也应重新气体室。 氧传感器（电极/压力计），允许在细胞/室中的O 2的测量，将提供一个细胞内/室O 2的含）更精确的测量。 培养细胞在不同的时间长度，时间曲线，将有助于确定的最佳时间在您的特定细胞中HIF -1α表达。 3。缺氧的评价 HIF – 1的免疫印迹检测α。 重新打开你的商会在第2.2节所述，立即置于冰上文化。 然后用5％SDS在解决板块裂解缺氧治疗组和非治疗细胞转移细胞lyzate管，超声，转速减速（spindown）的细胞碎片，收集上清。 测量蛋白质浓度用BCA试剂盒，准备样品加入样缓冲液，在95℃加热5分钟。 Electrophorese 8％SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜蛋白质。 膜在PBS中，含有5％非脱脂奶粉和0.1％吐温20座在室温下1小时或4℃摇床过夜。 免疫印迹法与反HIF -1α的主要单克隆抗体在同一个缓冲区（1 / 600）在4 ° C过夜洗净，用含0.1％吐温20在室温下，5分钟，每次孵育HRP二级抗体（1 / 2000）的PBS + 0.1％吐温20为45分钟的3倍。 洗净，用含0.1％吐温20在室温下，5分钟/时间的3倍。 皮尔斯ECL试剂盒和X光片显示蛋白带 缺氧反应元件（HRE）。 HIF -1α调控许多基因（即血管内皮生长因子，促红细胞生成素），通过结合到一个序列称为缺氧调节元件（HRE）。使用人权教育相关的一个标记基因的我t是可以检测HIF活动9。若要使用此方法，首先你需要你的细胞转染与人权教育的荧光素酶质粒使用适合您的细胞转染方法的。例如，我们用脂质体2000。细胞需要转染至少4个小时之前，在低氧和常氧孵育。时间允许的DNA进入细胞，因此，这第一步不是缺氧的影响。使用荧光素酶检测试剂盒，荧光素酶检测到信号。 孵育您的HRE转染的细胞在缺氧模块化室或使用的HRE转染的细胞孵育CoCl 2，包括常氧控制。 所需的潜伏期后，从细胞中移除的生长介质。 在PBS冲洗细胞，去除PBS。 免除到培养皿400μl1X裂解试剂，并刮去贴壁细胞，然后将它们传输到一个微型管。 短暂离心颗粒碎片。 混合20μL细胞裂解液上清与萤光素酶检测试剂100μL和使用光度计测量发光。 4。代表性的成果： 在K562细胞（人白血病细胞株）培养2天，含氧量低，相比常氧，缺氧诱导增加HIF -1α蛋白免疫印迹（图1）检测。 使用的HRE -荧光素酶改性293细胞（人胚肾细胞系）在缺氧培养，显着增加，在缺氧细胞HIF -1α活动检测（图2）。 图1：增加缺氧细胞HIF -1α。 K562细胞在常氧和缺氧（缺氧室）培养48小时，并使用一种抗体具体为HIF -1α的西部印迹分析。为肌动蛋白抗体的具体用于装载控制。 图2：HIF -1α的活动 。荧光素酶的HRE修改293细胞培养在低氧和常氧48小时，然后裂解使用荧光素酶检测试剂盒和光度计检测荧光素酶的信号。结果表示为相对发光单位（RLU）。