Прямое наблюдение Фагоцитоз и NET-формации Нейтрофилы в Зараженные легкие с помощью 2-фотонной микроскопии
Summary
Мы покажем, как использовать 2-фотонной микроскопии для наблюдения за динамикой нейтрофильных гранулоцитов в зараженных легких, пока они фагоцитируют патогены или производить нейтрофилов внеклеточной ловушек (НРТ).
Abstract
После желудочно-кишечного тракта, легких является второй по величине поверхность для взаимодействия между позвоночными тела и окружающей среды. Здесь, эффективного обмена газа должна быть сохранена, и в то же время избежать заражения нескольких патогенов, которые в виде ингаляций при нормальном дыхании. Чтобы добиться этого, превосходный набор стратегий защиты объединения гуморальный и клеточный иммунные механизмы существует. Одним из наиболее эффективных мер по острым защиту легких набора нейтрофилов, которые либо фагоцитируют вдыхании возбудителей или убить их, выпуская цитотоксические химические вещества. Недавнее дополнение к арсеналу нейтрофилами является их взрывного внеклеточной ДНК-НРТ помощью которых бактерии или грибы могут быть пойманы или инактивированных даже после NET выпуская клетки умерли. Мы приведем здесь метод, который позволяет непосредственно наблюдать нейтрофилы, мигрирующие в пределах недавно инфицированных легких, phagocytosing грибковых возбудителей, а также визуализировать обширные сети, которые они произвели всей инфицированной ткани. Метод описывается подготовка толстой жизнеспособной ломтиками легких 7 часов после интратрахеального инфекции мышей с конидий Aspergillus fumigatus плесень и их рассмотрения многоцветной покадровой 2-фотона микроскопии. Такой подход позволяет непосредственно исследовать противогрибковые обороны в родных легочной ткани и таким образом открывает новые возможности для детального исследования легочной иммунитет.
Protocol
Discussion
В режиме реального времени 2-фотона микроскопии в естественных условиях или в интактных органов приобрела глубокое значение для исследований, посвященных физиологии клетки иммунной системы в течение последних 10 лет. Именно с этой техникой, что важные события, как динамика активации Т-клеток в лимфатических узлах впервые стал видимым 2-4. Совсем недавно ученые также начали анализировать специфические клеточные функции, как первые шаги в поколение эффекторных клеток в лимфатических тканях с использованием этого подхода 5.
Однако, несмотря на ряд новых биологических понятий были выявлены с помощью этого метода, Есть еще сложные и важные вопросы, по которым не прижизненной визуализации исследований были опубликованы до сих пор. Примечательно это относится к млекопитающим легких. Интересный аспект этого органа, как вступление порт для различных воздухе патогенных микроорганизмов, делает его одним из самых важных поверхностей, на которых иммунологические процессы происходят в организме млекопитающих. С каждым дыханием в течение всей жизни, нежелательных частиц в виде ингаляций, некоторые из которых есть потенциал, чтобы вызвать опасные для жизни инфекции 6. Это говорит само за себя, что в такой чувствительной и исчезающих сайт плотная сеть защитных механизмов должен присутствовать выставке весь репертуар иммунного ответа. С другой стороны, это очень важно, что индуцированная иммунологическая борьбы с потенциально патогенных микроорганизмов в такой "грязной" место под жестким контролем. Преувеличенные реакции иммунной системы несут высокий риск нанесения вреда собственному телу через широкомасштабное ранив ткани органа при стимуляции неспецифической иммунной действия ячейки 7,8.
В свете этих мыслей было бы чрезвычайно интересно и полезно иметь возможность исследовать поведение клеток млекопитающих легкие под истинным в естественных условиях. Однако тот факт, что такая система до сих пор не были успешно реализованы ясно указывает на огромные трудности, которые должны быть решены в создании рабочей протокола. Наиболее трудная задача, вероятно, это сосредоточиться стабильности. Легких, как органа, ответственного за дыхание под постоянным движением во всех трех направлений пространства для реализации ингаляции. Уже одно это обстоятельство вызывает серьезные проблемы с изображениями и можно считать прижизненной тепловизоры "кошмар". Уже легкое движение, чтобы в любой размерности пространства массивным ухудшение влияние на микроскопическом зрения, которая должна быть стабильной микрометром точностью в целях получения значимых изображений 9. Учитывая жесткие по своей сути подходом 10, 2-фотонного микроскопа еще более чувствительны к координационным неустойчивости, как вывих определенную структуру в пределах от нескольких микрометров в Z-направлении эквивалентно полной потере внимания и, следовательно, Неудачный эксперимент.
Протокол, представленные в этом исследовании для наблюдения иммунные клетки в мышиный легких по-прежнему не в естественных условиях применения, но довольно близко приближение к ситуации в функционально нетронутыми легких 11. Ex подходы естественных условиях для работы с изображениями лимфоцитов, например, в эксплантированных лимфатических узлы, как было показано, давать результаты эквивалентны истинным прижизненных наблюдений 12 и, таким образом, весьма актуальной 5. Наблюдений в точке в легких ломтиками, которые возможны только с нашим подходом, состоится в инфицированных легких вскоре после иссечения. 3D целостности во время процесса резки обеспечивается агарозном матрице, необходимым шагом, чтобы точно контролировать процесс резки из легких. Хотя это необходимо охладить эксплантированных легких в течение короткого периода, чтобы затвердевания агарозном матрицы, можно вернуться в ближайшее физиологические условия для клеток после резки и согревание тканей. Это ясно показывают наши данные, которые демонстрируют, что в этих условиях нейтрофилов обладают высокой активностью и проявляют весь свой потенциал в качестве гибкой фагоцитов, которые необходимы для эффективной очистки инфекции Aspergillus fumigatus. Они патрулируют легочной ткани, проходящие через эпителиальные барьеры, чтобы достигнуть внутренней части альвеол и кроме того, они активно занимают грибковые споры 11. Основной вывод этой работы стало появление структур, напоминающих нейтрофилов внеклеточной ловушек (НРТ) в Aspergillus инфицированных органов. Сетки совсем недавнее обнаружение механизма романа обороны в нейтрофилов 13. Тем не менее, с момента ее первоначального описания в 2004 году, ряд физиологических или патологических состояний на животных моделях или людей, где это явление наблюдается или не хватает был взрывным увеличением 14-16. Интересно, что хотя так много работы было потрачено на эти структуры, так много различных групп, в большинстве докладов все еще находятся на очень описательный уровень и не так многоизвестно о механизме NET выпуска и ее регулирования. С нашей протокола мы смогли в первый раз, чтобы показать NET волокон в инфицированных легких. Кроме того, мы могли бы продемонстрировать важность недавно набранных нейтрофилов, а также молекулярные грибковых структур для их возникновения или торможения 11. Это наглядно демонстрирует потенциал нашего метода для исследования одного шаги NET формирование более подробно. Можно было подумать, например, для использования нейтрофилов из подходящих нокаут мышей, чтобы наблюдать за их способности NET образования в приемные экспериментов передачи.
Таким образом, хотя прямого наблюдения нейтрофилов иммиграции из периферической крови не представляется возможным в этой системе из-за отсутствия кровоснабжения органов после эксплантации, мы все еще верим, что наш протокол является ценным и сравнительно просты в обращении подход, который позволяет визуализацию рано или поздно шагов в иммунной защиты от инфекций легких. Это, следовательно, важным шагом на пути исследования этого явления в легких дыхание живых животных.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Ларса Philipsen за помощь в оптимизации прижизненной фильмы, д-р Джонатан Линдквист за внимательное чтение рукописи, и все члены лаборатории Gunzer за полезные обсуждения и замечания при разработке метода. Эта работа финансировалась грантами от Deutsche Forschungsgemeinschaft (ДФГ, SFB 854) М. Г.
References
- Faust, N. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-719 (2000).
- Gunzer, M. A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo. Blood. 104, 2801-2801 (2004).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-154 (2004).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).
- Beuneu, H. Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes. Immunity. 33, 412-412 (2010).
- Aimanianda, V. Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores. Nature. 460, 1117-1117 (2009).
- Snelgrove, R. J. A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation. Science. 330, 90-90 (2010).
- Chou, R. C. Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis. Immunity. 33, 266-266 (2010).
- Nitschke, C. 3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo. Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).
- Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. Intravital 2-photon microscopy – focus on speed and time resolved imaging modalities. Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).
- Bruns, S. Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).
- Brinkmann, V. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303, 1532-1532 (2004).
- Marcos, V. CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation. Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).
- Clark, S. R. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nat Med. 13, 463-463 (2007).
- Bianchi, M. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2619 (2009).
