Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

1. Infectie Gezwollen sporen van de schimmel Aspergillus fumigatus (stam ATCC 46645), worden gegenereerd door pre-incubatie in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlijn, Duitsland), aangevuld met 5% FCS (v / v). 2×10 7 rust conidia zijn geresuspendeerd in 5 ml medium en geïncubeerd in een 6-well weefselkweek plaat (TPP AG; Trasadingen, Zwitserland, catalogus # 92006) voor 7 uur bij 37 ° C. Na de zwelling periode worden de sporen fluorescent gelabelde door het toevoegen van 10 pi van calcofluor witte stockoplossing (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Duitsland, catalogus # F3543; [25 mg / ml] in DMSO) aan elke Aspergillus met goed in het 6-well plaat, het bereiken van een uiteindelijke calcofluor concentratie van 50 ug / ml RPMI. Na voorzichtig mengen, zijn de sporen geïncubeerd voor een extra 15 minuten bij 37 ° C. In de volgende stap worden de sporen geoogst door filtratie door een 70 um cel zeef (BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland). Na het wassen een keer met 10 ml PBS (centrifuge op 900xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur) de pellet wordt geresuspendeerd in 2 ml PBS en het totale aantal gezwollen conidia bepaald door het tellen met een Neubauer kamer. Tenslotte wordt de sporensuspensie wordt gesponnen neer op 900xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, is het supernatant voorzichtig verwijderd en de pellet geresuspendeerd tot de uiteindelijke concentratie van 1×107 sporen per 100 ul PBS. Voor infectie, is 100 ul van de spore-oplossing intratracheaal toegepast in vrouwelijke muizen (C57/BL6, 8-10 weken oud, Harlan, Duitsland). Als neutrofielen zijn om ook in acht worden genomen, is het gebruik van Lys-EGFP muizen, die EGFP onder de lysozyme promotor een aan te bevelen. Begin met verlamming van het dier met een enkel IP-injectie van 150 ul Ketamin / Rompun-oplossing (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Duitsland (Ketamin) en Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Duitsland (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml steriel NaCl [0,9%]). 5 minuten later de verdoofde muis kan worden vastgesteld met een elastische band door zijn tanden aan de helling (dwz een schuin oppervlak) aan de intubatie (aanvullende figuur 1) te vergemakkelijken. Met behulp van pincet, is de tong naar een kant getrokken en een 22G inwonende veneuze katheter (B. Braun AG, Melsungen, Duitsland, Vasofix Braunüle) kan voorzichtig worden ingebracht in de luchtpijp onder permanente verlichting met een zwanenhals lamp. De succesvolle inbrengen van de katheter wordt gecontroleerd door het observeren van regelmatige beweging van de thorax van het dier met de frequentie van de mechanische ventilator. Wanneer de succesvolle intubatie is bevestigd, is 100 ui sporesuspensie aangebracht met behulp van een 100 ul micropipet. Dit volume moet worden ingeademd door het dier, zonder bijkomende hulp in 1-2 s. Een verbeterde verdeling van de schimmel deeltjes in de longen wordt bereikt door mechanisch ventileren het besmette dier gedurende 2 minuten met een klein dier ademhalingstoestel (MiniVent, Hugo Sachs, maart-Hugstetten, Duitsland) tegen een tarief van 250 ademhalingen per minuut en een inhalatie volume van 300 ul per ademhaling (aanvullende figuur 2). Na de infectie dieren terug naar hun kooi en geobserveerd om de 5 minuten tot ambulante weer. Muizen vertonen geen tekenen van pijn of ongemak tijdens de volgende incubatietijd. 2. Lung voorbereiding 7 uur na besmetting met de sporen, is het dier gedood door een overdosis van isofluraan (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Duitsland) tot de bewegingen en ademhaling hebben opgehouden voor meer dan 30 seconden. Dit wordt dan gevolgd door thoracotomie als een secundaire methode om klinisch dood te verzekeren en zorgen voor visualisatie en de toegang van de luchtpijp en longen. Dan de borst wordt zorgvuldig geopend voor de longen en de bovenste luchtwegen bloot te leggen. Dan nog een 22G inwonende veneuze katheter wordt ingebracht in de luchtpijp vanaf de blootgestelde epiglottis. Door deze tubulus de longen zijn gevuld met 1 ml voorverwarmd laagsmeltende agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Duitsland) met een 1 ml spuit Omnifix (B. Braun). Zodra de longen worden gevuld van de luchtpijp wordt afgebonden met een kort stukje naaigaren en het hele dier wordt in een koelkast bij 4 ° C. 15 min later, wanneer de agarose gestold is, wordt de hele long weggesneden begin van de luchtpijp. Met behulp van een paar scherpe puntige schaar, de rechter long kwab wordt vervolgens verwijderd, wordt de onderkant kort gedroogd op een vel vloeipapier en vervolgens de hele kwab is vastgelijmd aan de voorbereiding blok van een vibratome (Campden Instruments, Verenigd Koninkrijk, 752M Vibroslice ) met behulp van een druppel weefsel lijm voor de bevestiging (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Duitsland, Roti-Coll 1). Na 1 minuut het blok is geïnstalleerd in de maaikamer van de vibratome, die gevuld is met pre-gekoeld (4 ° C) PBS. De vibratome is ingesteld op een mid-range trilling (5 van de 10 Max.) En ook een matige snelheid (5 van de 10 Max.) Zodanig dat een horizontale doorsnede van delongen wordt geproduceerd. De bovenste helft van het orgel wordt dan overgebracht naar een kleine plastic petrischaaltje (5 cm diameter) waar het wordt omgekeerd en vastgezet met een zelfgemaakte platte ring (1 cm inwendige diameter), die wordt gedekt door een reeks van parallelle nylon draden, elk 1 mm van elkaar (aanvullende figuur 3). Tenslotte wordt de petrischaal is gevuld met 10 ml PBS aangevuld met 10 ul van de DNA-kleurstof Sytox Oranje [5 mM] (Invitrogen, Duitsland), wat resulteert in een uiteindelijke kleurstof concentratie van 5 uM. 3. Twee-foton laser microscopie De petrischaal met daarin de longen monster wordt vervolgens geïnstalleerd onder de microscoop doel, zodat de buffer kan worden opgewarmd tot 37 ° C met een temperatuur sensor-gestuurde verwarming (aanvullende figuur 4). Twee-foton microscopie wordt dan uitgevoerd over de hele snijvlak met behulp van een Zeiss LSM 710 NLO microscoop op een rechtopstaande Axio Examiner podium uitgerust met een 20xNA1.0 water dompelen lens (Zeiss, Jena, Duitsland). Voor imaging, zijn verschillende gebieden langs de sectie gescand naar beneden tot 400 micrometer diepte met behulp van een verlichting golflengte van 800 nm opsporen van groen (530 nm) en rood (580 nm) fluorescentie, evenals de tweede harmonische generatie (SHG)-signaal en de blauw calcofluor fluorescentie (bij 400-470 nm emissie) met externe niet descanned detectoren (NDD). Naast de 2-D foto's en time lapse filmpjes (een beeld per 5-10 seconden), kunnen enkele of herhalingsduik 3-dimensionaal beeld stacks vervolgens worden weergegeven als voxel renderings of single uitgebreid onscherpe beelden of 4-D data (3D loop van de tijd) met behulp van verschillende software pakketten. Deze microscopisch kleine opstelling laat de observatie van cellulaire gedrag in een bijna intact milieu dat, zoals vormt de toegangspoort voor een verscheidenheid van de lucht pathogenen, is van enorme immunologische relevantie. Celbeweeglijkheid, fagocytose en NET productie door endogene neutrofielen na infectie met de schimmel Aspergillus fumigatus kan eenvoudig worden onderzocht onder deze in situ-omstandigheden. 4. Representatieve resultaten Indien het wordt gedaan juist de beeldvorming zal genereren 2 – of 3-kleuren dia's of films. Hoewel de kleur is gedaan in een post processing procedure en is dus vrijelijk aanpasbaar, wij in het algemeen selecteert u een kleur-regeling die de natuurlijke kleur van de kleurstof / signaal, dat wordt gedetecteerd in de relatieve kanaal weerspiegelt. Zo zijn de Sytox kleurstoffen afgebeeld in het rood, de schimmel en de SHG-signaal wordt in blauw weergegeven en, indien aanwezig, EGFP-gelabelde cellen zijn gekleurd in het groen. In het eerste voorbeeld (fig. 1) het blauwe SHG-signaal geeft het weefsel vezels van een niet-geïnfecteerde longen en het rode Sytox signaal wordt geproduceerd door kernen van long-inwoner cellen te openen door de vibratome snijden. In het tweede voorbeeld (fig. 2) een besmette long wordt getoond, waar zowel, alveolaire structuren en schimmel massa's, verschijnen in het blauw, terwijl de kernen en de netten zijn gekleurd rood. Het derde voorbeeld (afb. 3) is uit een Lys-EGFP transgeen dier waar naast de blauwe en rode structuren van de groene neutrofielen ook kan worden gezien. De migratie van neutrofielen en hun fagocytose van individuele schimmels elementen in time lapse sequenties wordt weergegeven in de aanvullende film. Figuur 1. Het uiterlijk van een niet-besmette long slice in 2-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice werd bereid uit een niet-geïnfecteerde C57/BL6 muis en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Hier gepresenteerde zijn de SHG signaal van de alveolaire weefsel structuur (A), de Sytox signaal van celkernen opengesneden tijdens de voorbereiding van de long slice (B), en een overlay van de twee kanalen (C). De doos gebied in (C) wordt gezien vergroot (D). Let op: het vezelige weefsel aan de onderkant van de long slice ten opzichte van de duidelijk alveolaire organisatie binnen de ademhaling-actieve gebieden van de long hierboven. Figuur 2. De verschijning van een long slice van een Aspergillus besmet wild type dier in twee-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice van een C57/BL6 muis besmet 7 uur voor het met A. fumigatus was bereid en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Afgebeeld is het gecombineerde schimmel structuur en de SHG van de alveolaire weefsel (A), de Sytox signaal van DNA-NET's alsmede celkernen opengesneden tijdens de voorbereiding van de long slice (B), en een overlay van de twee kanalen (C) . De doos gebied in (C) wordt gezien vergroot (D). Let op, zijn de duidelijk verschillende gebieden van de schimmel massa's, longblaasjes, en NET-structuren gemarkeerd met de letters F, A en N, respectievelijk. Figuur 3. De verschijning van een long slice van een Aspergillus geïnfecteerde Lys-EGFP dier in 3-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice van een Lys-EGFP muis software heeft 7 uur voor het metA. fumigatus was bereid en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Afgebeeld is het gecombineerde schimmel structuur en de SHG van de alveolaire weefsel (blauw), de Sytox signaal van celkernen en netten (rood), en evenals talrijke neutrofielen (groen). Aanvullende figuur 1. Muis fixatie voor de intubatie. Onder Ketamin / Rompun anesthesie van het dier wordt bevestigd met een elastische band op zijn tanden om de intubatie te vergemakkelijken met een 22G inwoning veneuze katheter. Aanvullende figuur 2. Mechanische ventilatie muis. Geïntubeerd De muis is geïnfecteerd door een IT-toepassing van 1×10 7 sporen geresuspendeerd in 100 ul PBS. Een verbeterde verdeling van de schimmel deeltjes in de longen wordt bereikt door mechanisch ventileren de geïnfecteerde muis met een klein dier masker. Aanvullende figuur 3. Longkwab fixatie. Na de bereiding van de rechter long kwab het orgel is vastgesteld in een petrischaal met behulp van een laboratorium-en-klare platte ring die wordt gedekt door een reeks van parallelle nylon draden. Aanvullende figuur 4. Twee-foton beeldvorming setup. De petrischaal met de rechter long kwab is geïnstalleerd op een mat onder de twee-foton microscoop na toevoeging van de DNA-kleurstof Sytox Orange. Aanvullende film:. Neutrofielen migratie en fagocytose schimmel Aspergillus elementen in geïnfecteerde longen zoals gezien door tijdsverloop twee-foton microscopie van een levende long slice zeven uur na infectie met de schimmel Neutrofielen zijn groen, schimmel-elementen en SHG zijn blauw, en celkernen als evenals NET-structuren zijn weergegeven in het rood. De real-time van het experiment wordt getoond op de onderste rechts. De schaal bar geeft 50 micrometer. Klik hier om video te bekijken