المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون
Summary
نظهر ، وكيفية استخدام 2 – الفوتون المجهري لمراقبة ديناميات المحببة العدلة في الرئتين المصابين وهم يبلعم مسببات الأمراض أو إنتاج الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات).
Abstract
بعد الجهاز الهضمي ، وسرطان الرئة هو السطح ثاني أكبر للتفاعل بين الفقاريات الجسم والبيئة. هنا ، يجب الحفاظ على تبادل الغاز فعالة ، بينما في الوقت ذاته على تجنب الإصابة من مسببات الأمراض المتعددة التي يتم استنشاقه أثناء التنفس الطبيعي. لتحقيق ذلك ، مجموعة رائعة من استراتيجيات الدفاع الجمع بين آليات المناعة الخلوية والخلطية موجودا. أحد التدابير الأكثر فعالية للدفاع حادة في الرئة هو توظيف للعدلات التي يبلعم إما استنشاق الجراثيم أو قتلهم عن طريق الإفراج عن المواد الكيميائية السامة للخلايا. وبالإضافة إلى ذلك مؤخرا إلى ترسانة من العدلات هو الافراج عنهم من المتفجرات المستجدة الحمض النووي خارج الخلية التي يمكن من خلالها اكتشاف البكتيريا أو الفطريات أو المعطل حتى بعد الافراج عن الخلايا NET لقوا حتفهم. نقدم هنا الأسلوب الذي يسمح احد لمراقبة مباشرة العدلات ، يهاجرون داخل الرئة المصابة مؤخرا ، مسببات الأمراض الفطرية phagocytosing كذلك تصور مثل المستجدة الواسعة التي كانت قد أنتجت في جميع أنحاء الأنسجة المصابة. ويصف طريقة تحضير شرائح سميكة الرئة قابلة للحياة بعد 7 ساعات من العدوى داخل الرغامى مع الفئران غبيرات من العفن الرشاشية الدخناء ودراستها من قبل المجهري متعدد الألوان 2 – الفوتون مرور الزمن. هذا النهج يسمح احد لتحقيق دفاع مضاد مباشرة في أنسجة الرئة الأصلية وبالتالي يفتح طريقا جديدا لتحقيق مفصل من الحصانة الرئوي.
Protocol
Discussion
وقد اكتسبت في الوقت الحقيقي 2 – الفوتون المجهري في الجسم الحي أو في الأجهزة سليمة أهمية دراسات عميقة في التعامل مع علم وظائف الأعضاء من الخلايا المناعية على مدى السنوات ال 10 الماضية. كان مع هذا الأسلوب أن أحداثا هامة مثل ديناميات تي خلية التنشيط داخل الغدد الليمفاوية مرئية لأول مرة 2-4. في الآونة الأخيرة ، بدأ الباحثون أيضا إلى تحليل وظائف محددة مثل الخلوية الخطوات الأولى في توليد خلايا الأنسجة اللمفاوية المستجيب في استخدام هذا النهج 5.
ومع ذلك ، وإن كانت قد كشفت عن وجود عدد من المفاهيم البيولوجية الجديدة باستخدام هذا الأسلوب ، لا تزال هناك تحديات والمسائل الهامة التي لم تنشر دراسات intravital التصور حتى الآن. وهذا ينطبق خصوصا على الرئة الثدييات. الجانب المثير في هذا الجهاز ، وميناء الدخول لمجموعة متنوعة من العوامل الممرضة المحمولة جوا ، ويجعل منها واحدة من أهم الأسطح التي تجري العمليات المناعية في الجسم الثدييات. مع كل نسمة على مدى الحياة بأكملها ، يتم استنشاق الجزيئات غير المرغوب فيها وبعضها لديها القدرة على إحداث العدوى 6 تهدد الحياة. انه غني عن الشرح أنه في مثل هذا الموقع الحساس والمهددة بالانقراض شبكة محكمة من آليات الدفاع يحتاج إلى أن تكون موجودة في معرض ذخيرة كاملة من الاستجابات المناعية. ومن ناحية أخرى فإنه من المهم جدا ان تخضع لرقابة صارمة الكفاح ضد مسببات الأمراض التي يسببها المناعية المحتملة في مثل هذا المكان "القذرة". ردود فعل مبالغ فيه من الجهاز المناعي تحمل مخاطر عالية من الإضرار التي أصابت جسده على نطاق واسع على أنسجة الجهاز تحفيز الخلايا المناعية غير محددة الإجراءات 7،8.
في ضوء هذه الأفكار سيكون من المهم للغاية ومفيدة لديها إمكانية للتحقيق في سلوك الخلايا في الرئتين الثدييات تحت ظروف حقيقية في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن مثل هذا النظام حتى الآن لم تنفذ بنجاح يشير بوضوح إلى الصعوبات الهائلة التي يتعين حلها في وضع بروتوكول للعمل. التحدي الأكثر تطلبا وربما الاستقرار التركيز. في الرئة والجهاز المسؤول عن التنفس تحت الحركة المستمرة في جميع الاتجاهات الثلاثة للفضاء لتحقيق الاستنشاق. هذا الظرف وحده يسبب مشاكل خطيرة التصوير ، ويمكن اعتبار intravital التصوير "كابوس". بالفعل حركة طفيفة على أي البعد في الفضاء له تأثير هائل على الرأي القائل تدهور المجهرية ، والتي تحتاج إلى أن تكون مستقرة مع الدقة ميكرومتر من أجل توليد صور ذات مغزى 9. نظرا تركيزها ضيق بطبيعته المحلية 10 ، 2 الفوتون المجهري هو أكثر حساسية لعدم الاستقرار التنسيق ، كما خلع من بنية معينة في مجموعة من ميكرومتر قليلة في Z – الاتجاه هو ما يعادل خسارة كاملة من التركيز ، وبالتالي تجربة فاشلة.
بروتوكول المعروضة في هذه الدراسة لرصد الخلايا المناعية في الرئة الفئران لا يزال ليس في التطبيق الجسم الحي ، وإنما هي تقريب وثيقا بالوضع في الرئة a سليمة وظيفيا 11. فيفو النهج السابق لمفاوي والتصوير ، وعلى سبيل المثال في الليمفاوية explanted وقد تبين أن العقد ، لتسفر عن نتائج حقيقية ما يعادل 12 في الملاحظات المجراة ، وبالتالي فهي ذات أهمية كبيرة 5. في الملاحظات على الموقع في شرائح الرئة ، والتي هي الوحيدة الممكنة مع نهجنا ، تجري في الرئة المصابة بعد وقت قصير من الختان. ويكفل سلامة 3D أثناء عملية القطع agarose المصفوفة ، وهي خطوة ضرورية للسماح لعملية قطع تسيطر على وجه التحديد في الرئة. على الرغم من أنه ضروري لتبريد الرئة explanted لفترة قصيرة للسماح للتصلب المصفوفة agarose ، فمن الممكن للعودة الى الظروف الفسيولوجية للخلايا القريب بعد إعادة التدفئة وقطع من النسيج. ويظهر ذلك بوضوح من خلال البيانات المتوفرة لدينا ، الأمر الذي يوضح أنه في ظل هذه الظروف العدلات نشطة للغاية ويحمل كامل إمكاناتهم والبالعات رشيقة ، والتي هي ضرورية لإزالة فعالة للعدوى الرشاشيات الدخناء. يقومون بدوريات على أنسجة الرئة التي تمر عبر الحواجز الظهارية من أجل الوصول إلى الأجزاء الداخلية من الحويصلات الهوائية ، وعلاوة على ذلك أنها تأخذ بنشاط الجراثيم الفطرية 11. وتمثلت النتيجة الرئيسية لهذا العمل ظهور هياكل تشبه الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات) في الجهاز الرشاشية المصابة. الحقائق المستجدة هي حديثة جدا لرواية آلية الدفاع في العدلات 13. ومع ذلك ، لأن الوصف الأولي في عام 2004 ، كان عدد من الشروط الفيزيولوجية المرضية أو في النماذج الحيوانية أو البشر حيث لوحظت هذه الظاهرة أو ينقص هو زيادة انفجارية 14-16. ومن المثير للاهتمام ، وإن كان قد أمضى الكثير من العمل على هذه الهياكل من قبل جماعات مختلفة كثيرة ، لا تزال معظم التقارير على المستوى الوصفي للغاية وليس كثيرامعروف عن آلية للإفراج NET ولائحته التنفيذية. مع بروتوكول لدينا تمكنا للمرة الأولى التي تظهر الألياف NET في الرئة المصابة. وعلاوة على ذلك ، فإننا لا يمكن التدليل على أهمية المعينين حديثا العدلات فضلا عن الهياكل الجزيئية لالفطرية وقوعها أو تثبيط 11. وهذا يدل بوضوح على احتمال اسلوبنا للتحقيق في واحدة من خطوات تشكيل NET بتفصيل أكبر. يمكن للمرء التفكير على سبيل المثال إلى استخدام العدلات من الفئران خروج المغلوب مناسبة لمراقبة قدرة على تشكيل NET في نقل التجارب بالتبني.
وهكذا ، على الرغم من أن الملاحظة المباشرة للهجرة العدلات من الدم المحيطي غير ممكن مع هذا النظام نظرا لعدم وصول الدم بعد explantation الجهاز ، ونحن ما زلنا نعتقد أن لدينا بروتوكول هو نهج قيمة وسهلة نسبيا للتعامل مع هذا يتيح للتصوير في وقت مبكر أو متأخر الخطوات في الدفاع المناعي ضد الالتهابات الرئوية. هذا هو ، بالتالي ، خطوة هامة نحو تحقيق هذه الظاهرة داخل الرئة في التنفس الحيوانات الحية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لارس Philipsen للمساعدة في تحقيق الاستفادة المثلى من الأفلام intravital ، والدكتور جوناثان ليندكويست لقراءة المخطوطة بعناية ، وجميع أعضاء المختبر لاجراء مناقشات مفيدة Gunzer والتعليقات خلال تطوير الأسلوب. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG ، SFB 854) إلى MG
References
- Faust, N. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-719 (2000).
- Gunzer, M. A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo. Blood. 104, 2801-2801 (2004).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-154 (2004).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).
- Beuneu, H. Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes. Immunity. 33, 412-412 (2010).
- Aimanianda, V. Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores. Nature. 460, 1117-1117 (2009).
- Snelgrove, R. J. A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation. Science. 330, 90-90 (2010).
- Chou, R. C. Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis. Immunity. 33, 266-266 (2010).
- Nitschke, C. 3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo. Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).
- Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. Intravital 2-photon microscopy – focus on speed and time resolved imaging modalities. Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).
- Bruns, S. Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).
- Brinkmann, V. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303, 1532-1532 (2004).
- Marcos, V. CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation. Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).
- Clark, S. R. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nat Med. 13, 463-463 (2007).
- Bianchi, M. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2619 (2009).
