Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie
Summary
Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).
Abstract
Nach dem Magen-Darm-Trakt, ist die Lunge der zweitgrößten Fläche für die Interaktion zwischen den Wirbeltieren Körper und die Umwelt. Hier muss eine effektive Gasaustausch aufrechterhalten werden, während gleichzeitig die Vermeidung einer Infektion mit dem eine Vielzahl von Krankheitserregern, die während der normalen Atmung eingeatmet werden. Um dies zu erreichen, besteht eine hervorragende Reihe von Abwehrstrategien Kombination humoralen und zellulären Abwehrmechanismen. Eine der wirksamsten Maßnahmen für die akute Abwehr der Lunge ist die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten, die entweder phagozytieren die eingeatmete Erreger oder töten sie durch Freisetzung zytotoxischer Chemikalien. Eine aktuelle Ergänzung zum bestehenden Arsenal von Neutrophilen ist ihre explosive Freisetzung von extrazellulären DNA-NETs, mit denen Bakterien oder Pilze verfangen oder inaktiviert werden auch nach dem Loslassen NET Zellen abgestorben sind. Wir stellen hier eine Methode, die man direkt beobachten Neutrophilen ermöglicht, die Migration in einem kürzlich infizierte Lunge, phagozytierenden pilzliche Erreger sowie Visualisierung der umfangreichen NETs, dass sie in das infizierte Gewebe produziert haben. Die Methode beschreibt die Herstellung von dicken lebensfähig Lung Slices 7 Stunden nach intratrachealer Infektion von Mäusen mit Konidien des Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus und deren Prüfung durch multicolor Zeitraffer-2-Photonen-Mikroskopie. Dieser Ansatz erlaubt es, direkt zu untersuchen antimykotische Verteidigung in nativen Lungengewebe und eröffnet damit einen neuen Weg für die detaillierte Untersuchung der pulmonalen Immunität.
Protocol
Discussion
Real-time 2-Photonen-Mikroskopie in vivo-oder in intakten Organen hat eine tiefgründige Bedeutung in Studien, die sich mit der Physiologie der Immunzellen in den vergangenen 10 Jahren gewonnen. Es war mit dieser Technik, die wichtige Ereignisse wie die Dynamik von T-Zell-Aktivierung in den Lymphknoten wurde erst sichtbar 2-4. In jüngster Zeit haben Forscher damit begonnen, spezifische zelluläre Funktionen wie die ersten Schritte in die Generierung von Effektor-Zellen in den lymphatischen Geweben mit diesem Ansatz 5 zu analysieren.
Doch obwohl eine Reihe von neuen biologischen Konzepten aufgedeckt wurden mit dieser Methode gibt es immer noch eine Herausforderung und wichtige Fragen, für die keine intravitalen Visualisierung Studien veröffentlicht wurden bislang. Insbesondere gilt dies für die Säuger Lunge. Der interessanteste Aspekt dieses Organs, als Eintrittspforte für eine Vielzahl von Luft-Erreger, macht ihn zu einem der wichtigsten Flächen, an denen immunologische Prozesse finden in den Körper von Säugetieren. Mit jedem Atemzug über die gesamte Lebensdauer, sind unerwünschte Partikel, von denen einige das Potenzial, lebensbedrohliche Infektionen hervorrufen 6 eingeatmet. Es ist selbstverständlich, dass bei einem so sensiblen und gefährdeten Ort ein dichtes Netz von Abwehrmechanismen vorhanden sein ausstellenden das gesamte Repertoire von Immunantworten benötigt. Auf der anderen Seite ist es sehr wichtig, dass die induzierte immunologische Kampf gegen potenzielle Krankheitserreger in einem solchen "schmutzigen" Ort eng kontrolliert wird. Übertriebene Reaktionen des Immunsystems tragen ein hohes Risiko der Schädigung des eigenen Körpers durch massiv verletzt Organgewebe nach Stimulation von unspezifischen Immunzellen Aktionen 7,8.
Im Lichte dieser Überlegungen wäre es sehr interessant und hilfreich, um die Möglichkeit, das Verhalten der Zelle in Säugetier-Lunge untersucht werden, unter echten Bedingungen in vivo haben. Die Tatsache jedoch, dass ein solches System bisher nicht erfolgreich weist eindeutig auf die enormen Schwierigkeiten, die in die Einrichtung einer Arbeitsgruppe Protokoll gelöst werden müssen umgesetzt werden. Die größte Herausforderung ist wahrscheinlich Fokus Stabilität. Die Lunge als Organ für die Atmung ist unter ständiger Bewegung in allen drei Richtungen des Raumes, um ein Einatmen zu realisieren. Allein dieser Umstand führt zu schweren Imaging Probleme und kann als eine intravitale Imager "Albtraum" werden. Schon eine kleine Bewegung, jedes beliebige Maß im Raum hat eine massive Verschlechterung der Wirkung auf die mikroskopische Ansicht, die mit Mikrometer-Präzision stabil, um zu erzeugen aussagekräftige Bilder zeigen 9 benötigt. Aufgrund ihrer von Natur aus eng lokalen Fokus 10, 2-Photonen-Mikroskopie ist sogar noch empfindlicher auf Schwerpunkte Instabilitäten, wie eine Versetzung von einer bestimmten Struktur im Bereich von wenigen Mikrometern in der Z-Richtung entspricht einem vollständigen Verlust des Fokus und damit ein gescheitertes Experiment.
Das Protokoll in dieser Studie für die Beobachtung von Immunzellen im murinen Lunge präsentiert ist noch nicht in vivo-Anwendung, sondern eine Annäherung an die Situation in einem funktionell intakten Lunge 11. Ex-vivo-Ansätze für die Bildgebung Lymphozyten, z. B. in explantierten Lymphknoten Knoten haben gezeigt, dass gleichwertige Ergebnisse wie mit echten in vivo-Beobachtungen 12 RENDITEOPT und sind daher von großer Bedeutung 5. Die in situ Beobachtungen in Lung Slices, die nur mit unserem Ansatz möglich, statt in einer infizierten Lunge kurz nach Exzision. Die 3D-Integrität während des Schneidens wird durch die Agarose-Matrix, ein wesentlicher Schritt, um eine genau kontrollierte Schneiden der Lunge ermöglichen gewährleistet. Obwohl es notwendig, die explantierten Lunge für einen kurzen Zeitraum zu einer Verfestigung der Agarose-Matrix erlauben cool ist, ist es möglich, in der Nähe von physiologischen Bedingungen für die Zellen nach dem Schneiden und Erwärmen des Gewebes zurück. Dies ist eindeutig durch unsere Daten, was bedeutet, dass unter diesen Bedingungen Neutrophilen sehr aktiv sind und zeigen ihr volles Potenzial als agile Fresszellen, die für die effektive Abfertigung eines Aspergillus fumigatus Infektion zu demonstrieren. Sie patrouillieren im Lungengewebe durch epitheliale Barrieren, um die inneren Teile der Alveolen zu erreichen und sie zudem aktiv aufgreifen Pilzsporen 11. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit war die Darstellung von Strukturen ähnlich Neutrophile extrazelluläre Traps (NETs) in der Aspergillus befallenen Organ. NETs sind eine sehr junge Feststellung eines neuen Abwehrmechanismus in Neutrophilen 13. Doch seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2004 hat die Zahl der physiologische oder pathologische Zustände in Tiermodellen oder Menschen, wo dieses Phänomen beobachtet worden ist oder fehlt, wurde explosionsartig steigenden 14-16. Interessanterweise, obwohl so viel Arbeit an diesen Strukturen wurde von so vielen verschiedenen Gruppen verbrachten, sind die meisten Berichte weiterhin auf einem sehr deskriptiven Ebene und nicht viel istbekannt über den Mechanismus der NET Version und ihrer Regulierung. Mit unserem Protokoll konnten wir zum ersten Mal auf NET-Fasern in einer infizierten Lunge zeigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, wie wichtig frisch rekrutierten neutrophilen Granulozyten sowie molekulare Pilzstrukturen für ihr Auftreten oder die Hemmung 11. Dies zeigt deutlich das Potenzial unserer Methode, um die einzelnen Schritte der NET-Bildung näher zu untersuchen. Man könnte denken, zum Beispiel an Neutrophile aus geeigneten knock-out Mäuse nutzen, um ihre Fähigkeit NET Bildung in Adoptiv-Transfer-Experimenten zu beobachten.
Obwohl also die direkte Beobachtung der neutrophilen Zuwanderung aus dem peripheren Blut ist nicht mit diesem System aufgrund der mangelnden Blutversorgung nach Organentnahme möglich ist, wir immer noch glauben, dass unser Protokoll eine wertvolle und relativ leicht zu handhaben Ansatz, der die Darstellung von ermöglicht, ist früh oder zu spät Schritte in der Immunabwehr gegen Infektionen der Lunge. Dies ist daher ein wichtiger Schritt zur Erforschung dieses Phänomens in der Atmung Lunge von lebenden Tieren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lars Philipsen für die Hilfe bei der Optimierung der Intravitalmikroskopie Filme, Dr. Jonathan Lindquist für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts danken, und allen Mitgliedern des Gunzer Labor für hilfreiche Diskussionen und Stellungnahmen, die während der Entwicklung der Methode. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) an MG finanziert
References
- Faust, N. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-719 (2000).
- Gunzer, M. A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo. Blood. 104, 2801-2801 (2004).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-154 (2004).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).
- Beuneu, H. Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes. Immunity. 33, 412-412 (2010).
- Aimanianda, V. Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores. Nature. 460, 1117-1117 (2009).
- Snelgrove, R. J. A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation. Science. 330, 90-90 (2010).
- Chou, R. C. Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis. Immunity. 33, 266-266 (2010).
- Nitschke, C. 3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo. Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).
- Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. Intravital 2-photon microscopy – focus on speed and time resolved imaging modalities. Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).
- Bruns, S. Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).
- Brinkmann, V. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303, 1532-1532 (2004).
- Marcos, V. CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation. Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).
- Clark, S. R. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nat Med. 13, 463-463 (2007).
- Bianchi, M. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2619 (2009).
