תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית
Summary
אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).
Abstract
לאחר העיכול, הריאות הוא השטח השני בגודלו עבור האינטראקציה בין הגוף חוליות ואיכות הסביבה. הנה, חילופי גז יעיל חייבת להישמר, ואילו באותו זמן הימנעות זיהום על ידי פתוגנים רבים כי הם נשאפים במהלך נשימה רגילה. כדי להשיג זאת, סט מעולה של אסטרטגיות ההגנה שילוב מנגנוני החיסון הלחות ואת הסלולר קיים. אחד האמצעים היעילים ביותר להגנה אקוטית של הריאות הוא גיוס של נויטרופילים, אשר גם phagocytose פתוגנים בשאיפה או להרוג אותם על ידי שחרור חומרים כימיים ציטוטוקסיות. בנוסף האחרונים לארסנל של נויטרופילים הוא לשחרר נפץ שלהם NETS תאי ה-DNA על ידי חיידקים או פטריות, אשר יכול להיתפס או מומת גם לאחר שחרור התאים NET מתו. אנו מציגים כאן שיטה המאפשרת להתבונן ישירות אחד נויטרופילים, נודדים בתוך ריאה נגועה לאחרונה, phagocytosing פתוגנים ופטריות כמו גם לדמיין את NETS נרחב שהם יצרו לאורך הרקמה הנגוע. השיטה מתארת את הכנת פרוסות עבות ריאות קיימא 7 שעות לאחר ההדבקה intratracheal של עכברים עם conidia של העובש אספרגילוס fumigatus ובדיקה שלהם על ידי מיקרוסקופ ססגוניות 2-פוטון זמן לשגות. גישה זו מאפשרת לנו לחקור ישירות הגנה נגד פטריות ברקמת הריאה יליד ובכך פותח דרך חדשה עבור החקירה מפורט של חסינות ריאתי.
Protocol
Discussion
בזמן אמת 2-פוטון מיקרוסקופית in vivo או באיברים שלמים צברה חשיבות רבה במחקרים העוסקים הפיזיולוגיה של תאים חיסוניים במהלך 10 השנים האחרונות. זה היה עם הטכניקה הזו, כי אירועים חשובים כמו הדינמיקה של הפעלת תא T בתוך בלוטות הלימפה הראשון הפך גלוי 2-4. לאחרונה, חוקרים החלו גם לנתח פונקציות סלולריות ספציפיות כמו הצעדים הראשונים בדור מפעיל תאים ברקמות הלימפה שימוש בגישה זו 5.
עם זאת, למרות מספר מושגים ביולוגיים חדשים נחשפו באמצעות שיטה זו, ישנם עדיין מאתגרת שאלות חשובות עבורו אין מחקרים להדמיה intravital פורסמו עד כה. יש לציין כי זו חלה על הריאות של יונקים. ההיבט המעניין של האיבר הזה, כנמל כניסה עבור מגוון רחב של פתוגנים מוטס, עושה את זה אחד המשטחים החשוב ביותר שבו תהליכים מתרחשים החיסונית בגופם של יונקים. עם כל נשימה על תוחלת החיים, חלקיקים לא רצויים הם נשאפים שבחלקם יש פוטנציאל לגרום לזיהומים מסכני חיים 6. זה מובן מאליו כי במקום כה רגיש וסיכנו רשת הדוקה של מנגנוני הגנה צריך להיות נוכח מציג את רפרטואר שלם של המערכת החיסונית. מצד שני זה מאוד חשוב שהמאבק החיסונית הנגרמת נגד פתוגנים פוטנציאליים מקום כזה "מלוכלך" נתונה לפיקוח הדוק. תגובות מוגזמות של המערכת החיסונית לשאת בסיכון גבוה של פגיעה בגופו על ידי פציעה של רקמות איבר מאסיבי על גירוי של תא החיסון נוקבים פעולות 7,8.
לאור המחשבות האלה זה יהיה מעניין מאוד מועיל יש את האפשרות לחקור את התנהגות התא בריאות יונקים תחת נכון בתנאים vivo. עם זאת, העובדה כי מערכת כזו עד כה לא יושמו בהצלחה בבירור מצביע על הקשיים העצומים שיש לפתור בהקמת פרוטוקול עבודה. האתגר התובעני ביותר כנראה הוא יציבות להתמקד. הריאות כגוף האחראי על הנשימה תחת תנועה מתמדת בכל שלושת הכיוונים של מרחב לממש שאיפה. תנאי זה לבד גורם לבעיות הדמיה חמורים יכולים להיחשב imagers intravital "סיוט". כבר תנועה קלה מימד בחלל יש השפעה מסיבית על הידרדרות להציג את מיקרוסקופיים, אשר צריך להיות יציב עם דיוק מיקרומטר על מנת להפיק תמונות בעלות משמעות 9. בהתחשב להתמקד הדוק מטבעו שלה המקומיות 10, 2-פוטון מיקרוסקופית הוא אפילו רגיש יותר אי יציבות מוקד, כמו פריקה של מבנה מסוים בטווח של רק כמה מיקרומטרים בכיוון-Z שווה לאובדן מלא של המוקד ובכך הניסוי נכשל.
פרוטוקול שהוצג במחקר זה לצורך השגחה של תאים חיסוניים בתוך הריאה Murine עדיין לא ביישום vivo, אלא הערכה קרובה למצב ריאה שלם מבחינה תפקודית 11. גישות Ex vivo עבור לימפוציטים הדמיה, למשל הלימפה explanted צמתים, הוכחו להניב תוצאות שוות ערך אמיתי תצפיות vivo 12 וכך הן רלוונטיות מאוד 5. בתצפיות באתרם פרוסות ריאה, אשר אפשרי רק עם הגישה שלנו, יתקיים ריאות נגוע זמן קצר לאחר כריתה. שלמות 3D בתהליך חיתוך מובטחת על ידי מטריקס agarose, צעד חיוני כדי לאפשר תהליך חיתוך מבוקר בדיוק של הריאה. אמנם יש צורך לקרר את הריאות explanted לתקופה קצרה כדי לאפשר התמצקות של מטריקס agarose, ניתן לחזור בתנאים פיסיולוגיים ליד עבור תאים לאחר חיתוך rewarming של הרקמה. זו מוצגת בבירור הנתונים שלנו, אשר מראים כי בתנאים אלה נויטרופילים פעילים מאוד ולהציג את מלוא הפוטנציאל שלהם כמו phagocytes זריז, אשר נחוצים פינוי יעיל של זיהום Aspergillus fumigatus. הם מפטרלים רקמת הריאה עובר דרך אפיתל מחסומים כדי להגיע לחלקים הפנימיים של alveoli פעיל יתר על כן הם תופסים נבגי פטריות 11. ממצא מרכזי של עבודה זו הייתה הופעתו של מבנים דומים מלכודות תאי נויטרופילים (סלים) של אספרגילוס האיבר הנגוע. NETS הם ממצא האחרונות מאוד של הרומן מנגנון הגנה נויטרופילים 13. עם זאת, מאז הדיווח הראשוני שלה בשנת 2004, מספר מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים במודלים של בעלי חיים או בני אדם שבו התופעה נצפתה או חסר כבר בפיצוץ הגדלת 14-16. מעניין לציין, כי כל כך הרבה עבודה כבר בילה על מבנים אלה על ידי קבוצות רבות ושונות כל כך, רוב הדיווחים הם עדיין ברמה תיאורי מאוד ולא הרבהידוע על מנגנון של שחרור NET ורגולציה שלה. עם פרוטוקול שלנו הצלחנו בפעם הראשונה כדי להראות סיבים NET בריאה נגוע. יתר על כן, אנחנו יכולים להדגים את החשיבות של נויטרופילים גייס טרי, כמו גם מבנים מולקולריים פטרייתי עבור המופע שלהם או עיכוב 11. זה מראה בבירור את הפוטנציאל של השיטה שלנו כדי לחקור את אחד השלבים של היווצרות NET ביתר פירוט. אפשר לחשוב למשל להשתמש נויטרופילים מעכברים מתאים עקום החוצה כדי לבחון את יכולתם של היווצרות NET בניסויים העברת המאמצת.
לכן, למרות תצפית ישירה של העלייה נויטרופילים מן הדם ההיקפיים אינו אפשרי עם המערכת הזו בשל חוסר אספקת דם לאחר explantation איברים, אנחנו עדיין מאמינים כי פרוטוקול שלנו היא גישה יקר יחסית קל לטפל המאפשר הדמיה של צעדים מוקדם או מאוחר בהגנה החיסונית כנגד דלקות ריאה. זהו, אפוא, צעד חשוב לקראת חוקרת את התופעה בתוך הריאות בנשימה של בעלי חיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ד"ר לארס Philipsen לעזרה עם אופטימיזציה של סרטים intravital, ד"ר יונתן לינדקוויסט עבור בזהירות לקרוא את כתב היד, וכל אנשי המעבדה Gunzer לדיונים הערות מועילות במהלך הפיתוח של השיטה. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) ל MG
References
- Faust, N. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-719 (2000).
- Gunzer, M. A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo. Blood. 104, 2801-2801 (2004).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-154 (2004).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).
- Beuneu, H. Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes. Immunity. 33, 412-412 (2010).
- Aimanianda, V. Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores. Nature. 460, 1117-1117 (2009).
- Snelgrove, R. J. A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation. Science. 330, 90-90 (2010).
- Chou, R. C. Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis. Immunity. 33, 266-266 (2010).
- Nitschke, C. 3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo. Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).
- Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. Intravital 2-photon microscopy – focus on speed and time resolved imaging modalities. Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).
- Bruns, S. Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).
- Brinkmann, V. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303, 1532-1532 (2004).
- Marcos, V. CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation. Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).
- Clark, S. R. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nat Med. 13, 463-463 (2007).
- Bianchi, M. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2619 (2009).
