2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

1. Enfeksiyon Şişmiş konidya küf Aspergillus (suşu ATCC 46.645) ile desteklenmiş RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Almanya) ön-inkübasyon tarafından üretilen% 5 FCS (v / v). 2×10 7 dinlenme konidya 5 ml ortamda yeniden süspanse ve 6-iyi doku kültürü plakası (DYP AG; Trasadingen, İsviçre, katalog # 92.006) inkübe 37 ° 7h ° C 6-iyi de içeren her Aspergillus; şişme döneminin ardından, sporlar floresan calcofluor beyaz stok solüsyonu (DMSO [25 mg / ml] Sigma Aldrich, Deisenhofen, Almanya, katalog # F3543) 10 ul ekleyerek etiketlenir plaka, son bir calcofluor konsantrasyonu 50 mcg / ml RPMI ulaştı. Nazik karıştırma, sporlar, 37 ° C'de 15 dakika ek bir inkübe Bir sonraki adımda, sporlar, 70 mikron hücre süzgeç (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) ile filtrasyon ile hasat edilir. Pelet 2 ml PBS ve şişmiş Konidyumların Neubauer odasına sayma tarafından belirlenen toplam sayısı 10 ml PBS (oda sıcaklığında 5 dakika 900xg santrifüj) ile bir kez yıkadıktan sonra yeniden süspanse. Son olarak, spor süspansiyon, oda sıcaklığında 5 dakika 900xg aşağı bükülmüş, süpernatantı dikkatle kaldırılır ve pelet nihai konsantrasyonu 100 ul PBS başına 1×107 sporları için yeniden süspanse. Enfeksiyon, spor çözüm ul dişi farelerde (C57/BL6, eski 8-10 hafta, Harlan, Almanya) 100 intratrakeal uygulanır. Nötrofillerin yanı sıra dikkat edilmesi gereken ise, lizozim Promotor 1 altında EGFP taşıyan Lys-EGFP farelerin kullanımı tavsiye edilir. 150 ul Ketamin / Rompun çözüm (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya (Ketamin) ve Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Almanya (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] başlayın hayvan tek bir IP enjeksiyonu ile anestezi + 0.5 ml Rompun% [2] + 3.5 ml steril NaCl [% 0.9]). 5 dakika sonra anestezi fare dişleri entübasyon (ek Şekil 1) kolaylaştırmak için rampa (yani bir eğimli yüzey) elastik bir bant ile sabit olabilir. Forseps kullanarak, dil, tek taraflı ve 22G kalıcı venöz kateter (B. Braun AG, Melsungen, Almanya, Vasofix Braunüle) hafifçe kalıcı bir kaz boyun lamba ile aydınlatma altında trakea içine eklenebilir çekilir. Kateterin başarılı ekleme, mekanik ventilatör frekans hayvanın göğüs kafesi düzenli hareketlerini izleyerek tarafından doğrulanmadı. Başarılı entübasyon onaylandığı zaman, 100 ul spor süspansiyon, 100 ul mikropipet kullanılarak uygulanır. Bu ses 1-2 sn içinde herhangi bir ek yardım almadan hayvan tarafından inhale edilmelidir Mekanik olarak 2 dakika boyunca dakikada 250 nefes oranı ve 300 inhalasyon hacmi küçük bir hayvan respiratör (MiniVent Hugo Sachs, Mart-Hugstetten, Almanya) ile enfekte hayvan havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir ul nefes başına (ek Şekil 2). Enfeksiyon hayvanlar kendi kafesine geri döndü ve tekrar ayaktan kadar her 5 dakikada bir gözlenen sonra. Fare aşağıdaki kuluçka dönemi sırasında ağrı veya sıkıntı herhangi bir kanıt yoktur. 2. Akciğer hazırlık Sporlarla birlikte enfeksiyon 7 saat sonra, hayvanın aşırı dozda tarafından ötenazi izofluran (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Almanya) hareketleri ve solunum 30 saniyeden fazla durdurdu kadar. Bu daha sonra, ikincil bir yöntem olarak klinik ölüm sağlamak ve görselleştirme ve trakea ve akciğerler erişim için izin torakotomi takip edilmektedir. Sonra göğüs, akciğer ve üst solunum yolu açığa çıkarmak için dikkatle açıldı. Sonra başka bir 22G kalıcı venöz kateter maruz epiglot başlayarak trakea içine sokulur. Bu borucuk aracılığıyla akciğerlere 1 ml Omnifix şırınga (B. Braun) ile 1 ml önceden ısıtılmış düşük erime agaroz (2% w / v, Promega, Mannheim, Almanya) ile doldurulur. Trakea, akciğerler dolu olarak kısa bir parça dikiş ipliği ile bağlıdır ve tüm hayvan 4 bir buzdolabı koymak ° C. 15 dakika sonra, agaroz katılaşmış, tüm akciğer, trakea itibaren eksize edilir. Bir çift sivri makas kullanarak, sağ akciğer lob daha sonra kaldırılır, alt yüzeyi kısa süre içinde bir yaprak kağıt mendil kurutulur ve daha sonra tüm lob vibratome (Chipping Instruments, İngiltere, 752M Vibroslice hazırlanması blok yapıştırılmış ) fiksasyon için doku yapıştırıcısı (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya, Roti-Coll 1) bir damla. 1 dakika sonra blok önceden soğutulmuş (4 ° C) PBS ile doludur vibratome, kesme odasında yüklenir. Vibratome orta sınıf bir titreşim (10 max 5) ve aynı zamanda orta hızı (5, 10 max.) Böyle bir yatay kesitiakciğer üretilmektedir. Organ üst yarısında daha sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı Kendi kendine yapılan bir düz rondela (iç çapı 1 cm) ile ters ve sabit bir küçük plastik Petri kabı (5 cm çapında), aktarılır dışında her 1 mm (tamamlayıcı şekil 3). Son olarak Petri kabı 10 ml PBS ile desteklenmiş 10 ul DNA boya Sytox Turuncu 5 mcM son bir boya konsantrasyonu [5 mM] (Invitrogen, Almanya) ile doludur. 3. 2-foton lazer mikroskopisi Akciğer örnek içeren Petri kabı sonra tampon bir sıcaklık sensörü kontrollü ısıtıcı (ek Şekil 4) ile 37 ° C ısınmış olabilir, böylece mikroskop objektif altında yüklü. 2-foton mikroskopi sonra 20xNA1.0 suya daldırma lens (Zeiss Jena, Almanya) ile donatılmış bir dik Axio Examiner sahnede Zeiss LSM 710 NLO mikroskop kullanarak tüm kesim yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Görüntüleme için, bölüm boyunca farklı alanlarda tespit yeşil (530 nm) ve kırmızı (580 nm) floresans yanı sıra, ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyal ve 800 nm dalga boyunda bir aydınlatma ile 400 mikron derinliğe kadar taranır mavi calcofluor floresan olmayan harici descanned dedektörleri (NDD) (400-470 nm emisyon). 2-D görüntü ve zaman atlamalı filmleri (1 resim her 5-10 saniye) yanı sıra, tek veya tekrarlayan 3-boyutlu resim yığınlarını sonradan voksel kaplamalar kullanarak ya da tek uzun odak görüntü veya 4-D (zamanla 3D) olarak işlenecek farklı yazılım paketleri. Bu mikroskobik kurulum havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası oluşturur, muazzam bir immünolojik alaka, neredeyse bozulmamış bir ortamda hücresel davranış gözlem sağlar. Hücre motilite, fagositoz ve küf Aspergillus enfeksiyonu takiben endojen nötrofil NET üretim yerinde koşullarda kolayca bu altında incelenebilir. 4. Temsilcisi Sonuçlar Eğer yapılırsa düzgün görüntüleme 2 üretecektir – veya 3-renkli dia veya film. Boyama sonrası bir işleme prosedürü yapılır ve böylece özgürce adapte olmasına rağmen, genelde göreceli kanal tespit boya / sinyal, doğal renk yansıtan bir boyama düzenini seçin. Böylece, Sytox boyalar varsa, EGFP-işaretli hücrelerin yeşil lekeli, kırmızı, mantar gibi SHG sinyal mavi ile gösterilmiştir tasvir ve. İlk örnekte (Şekil 1) mavi SHG sinyali ile enfekte olmayan akciğer dokusu lifleri ve kırmızı Sytox sinyal, akciğer yerleşik hücrelerinin çekirdekleri tarafından üretilen vibratome tarafından kesilerek açılır gösteriyor. Hem de alveoler yapıların yanı sıra mantar kitlelerin, mavi renkte görünmesi, çekirdek ve NET'ler kırmızı lekeli ikinci örnekte (Şekil 2) virüslü bir akciğer, gösterilir. Üçüncü örnek (Şekil 3), yeşil, mavi ve kırmızı yapıların yanı sıra nötrofiller de görülebilir Lys-EGFP transgenik hayvan. Nötrofil ve zaman atlamalı dizileri bireysel mantar elemanlarının fagositoz göç tamamlayıcı film gösterilmiştir. Şekil 1. Enfekte olmayan akciğer dilim 2-renkli bir görünüm 2-foton mikroskopi. Akciğer dilim olmayan enfekte fare C57/BL6 hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülü. Alveoler doku yapısı (A) SHG sinyal burada Sunan akciğer dilim (B) ve iki kanal (C) bir yerleşim hazırlanması sırasında, hücre çekirdeğinin Sytox sinyal açık kesti. (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Akciğerin alt kısmında fibröz doku olarak yukarıdaki akciğer solunum aktif alanlar içinde açıkça alveoler organizasyona kıyasla dilim dikkat ediniz. Şekil 2. Aspergillus enfekte vahşi tip hayvan akciğer dilim 2-foton mikroskopi 2-renk görünümü. 7 saat enfekte C57/BL6 fare akciğer dilim A. önce fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveolar doku (A), DNA NET'ler Sytox sinyal yanı sıra hücre çekirdekleri hazırlanması sırasında (B) akciğer dilim kesilerek açılır ve iki kanal kaplama (C) . (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Lütfen dikkat, mantar kitleler, alveoller ve NET-yapıları açıkça farklı alanlarda sırasıyla E, A ve N harfleri ile işaretlenir. Şekil 3. 3-renk akciğer dilim Aspergillus enfekte Lys-EGFP hayvan bir görünüm 2-foton mikroskopi Lys-EGFP fare akciğer dilim 7 saat önce enfekteA. fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveoler doku (mavi), hücre çekirdekleri ve NET'ler (kırmızı) Sytox sinyal, yanı sıra yanı sıra çok sayıda nötrofil (yeşil). Tamamlayıcı rakam 1. Entübasyon için Fare fiksasyonu. Ketamin / Rompun anestezi altında hayvan dişlerini 22G kalıcı venöz kateter ile entübasyon kolaylaştırmak amacıyla elastik bir bant ile sabitlenir. Tamamlayıcı rakam 2. Mekanik fare ventilasyon entübe fare 100 ul PBS içinde yeniden süspanse 1×10 7 sporların bir uygulama tarafından bulaşır. Mekanik, küçük bir hayvan solunum ile enfekte fare havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir. Tamamlayıcı rakam 3. Akciğer lob fiksasyon organ sağ akciğer lob ön hazırlıktan sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı bir laboratuvar yapımı düz rondela kullanmak bir Petri kabındaki sabit . Tamamlayıcı rakam 4. 2-foton görüntüleme kurulum sağ akciğer lob içeren Petri kabı, boya Sytox Orange DNA eklenmesinden sonra 2-foton mikroskop altında bir ısıtma matı yüklü . Ek film: yaşayan bir mantar enfeksiyonu sonrası akciğer dilim 7 saat 2-foton mikroskopi zaman atlamalı görüldüğü gibi göç ve Aspergillus enfekte akciğerlerde mantar elemanları phagocytosing Nötrofiller Nötrofiller yeşil, mantar elemanları ve SHG mavi ve hücre çekirdekleri gibi NET yapıları kırmızı olarak tasvir edilmektedir. Deney gerçek zamanlı sağ alt köşesinde gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mm gösteriyor. videosunu izlemek için tıklayın