Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).
Après le tractus gastro-intestinal, du poumon est la surface la deuxième plus grande pour l'interaction entre le corps des vertébrés et de l'environnement. Ici, un échange gazeux efficace doit être maintenue, tout en évitant en même temps l'infection par les pathogènes multiples qui sont inhalés lors de la respiration normale. Pour y parvenir, un superbe ensemble de stratégies de défense alliant humorale et cellulaire des mécanismes immunitaires existe. Une des mesures les plus efficaces pour la défense aigu du poumon est le recrutement des neutrophiles, qui soit phagocyter les pathogènes inhalés ou les tuer en libérant des produits chimiques cytotoxiques. Un ajout récent à l'arsenal des neutrophiles est leur libération explosive de l'ADN extracellulaire-NET par lequel les bactéries ou les champignons peuvent être capturés ou inactivés, même après que les cellules libérant NET sont morts. Nous présentons ici une méthode qui permet d'observer directement les neutrophiles, migrent à l'intérieur d'un poumon infecté récemment, la phagocytose des pathogènes fongiques ainsi que de visualiser le NET vaste qu'ils ont produit dans le tissu infecté. La méthode décrit la préparation des tranches épaisses de poumon viables 7 heures après l'infection intra-trachéale de souris avec des conidies de la moisissure Aspergillus fumigatus et leur examen par multicolores time-lapse 2-microscopie biphotonique. Cette approche permet d'enquêter directement sur la défense antifongique dans les tissus pulmonaires natives et ouvre ainsi une nouvelle voie pour l'investigation détaillée de l'immunité pulmonaire.
En temps réel 2-microscopie biphotonique in vivo ou dans les organes intacts a gagné en importance profonde dans les études portant sur la physiologie des cellules immunitaires au cours des 10 dernières années. C'est avec cette technique que des événements importants tels que la dynamique de l'activation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques Premières Nations devenait visible 2-4. Plus récemment, les chercheurs ont aussi commencé à analyser des fonctions cellulaires, comme les premières étapes de la génération de cellules effectrices dans les tissus lymphatiques en utilisant cette approche 5.
Toutefois, bien qu'un certain nombre de nouveaux concepts biologiques ont été révélés en utilisant cette méthode, il ya encore des défis et des questions importantes pour lesquelles aucun des études de visualisation intravitale ont été publiés à ce jour. Notamment cela s'applique au niveau du poumon chez les mammifères. L'aspect intéressant de cet organe, comme le port d'entrée pour une variété de pathogènes aéroportés, en fait l'une des surfaces les plus cruciaux au cours de laquelle les processus immunologiques ont lieu dans le corps des mammifères. Avec chaque respiration au cours de la durée de vie, les particules indésirables sont inhalées dont certains ont le potentiel de provoquer des infections mortelles 6. Il est auto-explicatif que, à un tel site sensible et menacée d'un réseau serré de mécanismes de défense doit être présent présentant l'ensemble du répertoire des réponses immunitaires. D'autre part il est très important que la lutte contre les pathogènes induits immunologiques potentielles à un tel "sale" endroit est étroitement contrôlé. Réactions exagérées du système immunitaire supporter un risque élevé de nuire à son propre corps par les tissus des organes massivement blessant lors de la stimulation des cellules immunitaires non spécifiques actions 7,8.
A la lumière de ces réflexions, il serait extrêmement intéressant et utile d'avoir la possibilité d'enquêter comportement des cellules dans les poumons des mammifères en vrai dans des conditions in vivo. Cependant, le fait qu'un tel système n'a jusqu'à présent pas été appliquée avec succès clairement les points sur les difficultés énormes qui doivent être résolus dans la mise en place d'un protocole de travail. Le défi le plus exigeant est sans doute la stabilité de discussion. Le poumon est l'organe responsable de la respiration est sous le mouvement constant dans les trois directions de l'espace pour réaliser l'inhalation. Cette seule circonstance entraîne des problèmes d'imagerie grave et peut être considéré comme un intravitale imageurs "cauchemar". Déjà un léger mouvement à toute dimension dans l'espace a un effet massif sur la détérioration de vue microscopique, qui doit être stable avec une précision micrométrique, afin de générer des images significatives 9. Compte tenu de son orientation fondamentalement serrés locale 10, 2-microscopie biphotonique est encore plus sensible aux instabilités de contact, comme une dislocation d'une certaine structure de l'ordre de quelques micromètres dans la direction Z est équivalent à une perte complète d'intérêt et donc une expérience ratée.
Le protocole présenté dans cette étude pour l'observation des cellules immunitaires dans les poumons de souris n'est toujours pas une application in vivo, mais plutôt un rapprochement étroit avec la situation dans un poumon fonctionnellement intactes 11. Approches ex vivo les lymphocytes imagerie, par exemple dans la lymphe explantés nœuds, il a été démontré à donner des résultats équivalents à true dans 12 observations in vivo et sont donc très pertinents 5. Les observations in situ dans les tranches de poumon, qui ne sont possibles que grâce à notre approche, se déroulent dans un poumon infecté peu de temps après l'excision. L'intégrité 3D pendant le processus de coupe est assurée par la matrice d'agarose, une étape essentielle pour permettre un processus parfaitement contrôlé la coupe du poumon. Bien qu'il soit nécessaire de refroidir les poumons explantés pour une courte période afin de permettre une solidification de la matrice d'agarose, il est possible de revenir à proximité des conditions physiologiques des cellules après la coupe et le réchauffement des tissus. Ceci est clairement démontré par nos données, qui montrent que dans ces conditions neutrophiles sont très actifs et présentent leur plein potentiel comme phagocytes agiles, qui sont nécessaires pour l'apurement effectif de une infection à Aspergillus fumigatus. Ils patrouillent dans les tissus pulmonaires en passant par les barrières épithéliales en vue d'atteindre les parties intérieures des alvéoles et en outre, ils participent activement jusqu'à 11 spores fongiques. Une des principales conclusions de ce travail a été l'apparition de structures ressemblant à des neutrophiles pièges extracellulaires (EVF) dans les Aspergillus organe infecté. NET sont une conclusion très récente d'un mécanisme de défense roman dans les neutrophiles 13. Toutefois, depuis sa première description en 2004, le nombre de conditions physiologiques ou pathologiques dans des modèles animaux ou les humains, où ce phénomène a été observé ou fait défaut a été explosive croissante 14-16. Fait intéressant, bien que le travail tant de choses ont été consacrés à ces structures par tant de groupes différents, la plupart des rapports sont encore à un niveau très descriptive et n'est pas beaucoupsur le mécanisme de libération NET et sa régulation. Avec notre protocole, nous avons pu pour la première fois de montrer fibres NET dans un poumon infecté. Par ailleurs, nous avons pu démontrer l'importance de neutrophiles fraîchement recrutés ainsi que les structures moléculaires des champignons pour leur survenance ou l'inhibition 11. Cela montre clairement le potentiel de notre méthode pour étudier les étapes simples de la formation des NET en détail. On pourrait penser par exemple d'utiliser les neutrophiles de souris knock-out adaptée pour observer leur capacité de formation des NET dans des expériences de transfert adoptif.
Ainsi, bien que l'observation directe de l'immigration des neutrophiles du sang périphérique n'est pas possible avec ce système à cause du manque d'approvisionnement en sang après explantation d'organe, nous croyons toujours que notre protocole est une approche précieuse et relativement facile à manipuler qui permet l'imagerie de étapes tôt ou tard dans la défense immunitaire contre les infections pulmonaires. C'est donc une étape importante vers enquête ce phénomène dans les poumons de respiration des animaux vivants.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lars Philipsen de l'aide pour optimiser les films intravitale, le Dr Jonathan Lindquist pour les lire attentivement le manuscrit, et tous les membres du laboratoire pour les discussions Gunzer et commentaires très utiles lors du développement de la méthode. Ce travail a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) à MG