La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

1. Infección Conidios hinchada del hongo Aspergillus fumigatus (ATCC 46645) son generados por la pre-incubación en medio RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlín, Alemania) suplementado con 5% FCS (v / v). 2×10 7 de descanso conidios se resuspenden en 5 ml de medio y se incubaron en una placa de tejido de 6 pocillos (TPP AG; Trasadingen, Suiza, catálogo # 92006) de 7 horas a 37 ° C. Después del período de la inflamación, las esporas están marcados con fluorescencia mediante la adición de 10 l de solución calcofluor archivo (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemania, catálogo # F3543, [25 mg / ml] en DMSO) a cada uno de Aspergillus que contiene también en el de 6 pocillos placa, alcanzando una concentración final de calcofluor de 50 ug / ml RPMI. Después de mezclar suavemente, las esporas se incubaron durante 15 min a 37 ° C. En el siguiente paso, las esporas se recogen por filtración a través de un filtro de 70 micras de células (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Después de lavar una vez con 10 ml de PBS (centrifugar a 900xg durante 5 minutos a temperatura ambiente), el sedimento se resuspende en 2 ml de PBS y el número total de conidios hinchada determinado por contar con una cámara de Neubauer. Por último, la suspensión de esporas se centrifuga a 900xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se retira cuidadosamente, y se resuspendió el sedimento a la concentración final de 1×107 esporas por 100 l de PBS. Para la infección, 100 l de solución de esporas se aplica por vía intratraqueal en ratones hembra (C57/BL6, 8-10 semanas de edad, Harlan, Alemania). Si los neutrófilos se observa, así, el uso de Lys-EGFP ratones, llevando EGFP bajo el promotor lisozima 1 se recomienda. Comience por anestesiar al animal con una única inyección ip de 150 l ketamina / Rompun solución (INRESA Arzneimittel GmbH, Freiburg, Alemania (ketamina) y Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania (Rompun), 1 ml de ketamina [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml estéril de NaCl [0,9%]). 5 minutos más tarde el ratón anestesiado se puede solucionar con una banda elástica de sus dientes a la rampa (es decir, una superficie inclinada) para facilitar la intubación (figura suplementaria 1). Con unas pinzas, la lengua es empujada hacia un lado y un catéter venoso 22G (B. Braun AG, Melsungen, Alemania, Vasofix Braunüle) puede ser insertado al interior de la tráquea con una iluminación permanente con una lámpara de cuello de ganso. El éxito de la inserción del catéter se verifica al observar el movimiento regular del tórax del animal con la frecuencia de la ventilación mecánica. Cuando la intubación exitosa ha sido confirmada, 100 l suspensión de esporas se aplica mediante una micropipeta 100 microlitros. Este volumen debe ser inhalado por el animal sin ningún tipo de ayuda adicional en 2.1 s. Una mejora de la distribución de partículas de hongos en el interior del pulmón se logra mecánicamente la ventilación del animal infectado durante 2 minutos con un respirador de pequeños animales (MiniVent, Hugo Sachs, de marzo de Hugstetten, Alemania) a una velocidad de 250 respiraciones por minuto y un volumen de inhalación de 300 l por aire (figura complementaria 2). Después de la infección los animales son devueltos a su jaula y observar cada 5 minutos hasta que de nuevo ambulatorio. Los ratones no muestran ninguna evidencia de dolor o malestar durante el período de incubación siguientes. 2. Preparación de pulmón 7 h después de la infección con las esporas, el animal es sacrificado por una sobredosis de isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Alemania) hasta que los movimientos y la respiración han cesado desde hace más de 30 segundos. Esto es seguido por la toracotomía como un método secundario para asegurar la muerte clínica y permitir la visualización y el acceso de la tráquea y los pulmones. A continuación, el pecho se abrió cuidadosamente para exponer el pulmón y el tracto respiratorio superior. Luego, otro catéter venoso 22G se inserta en la tráquea a partir de la epiglotis expuestos. A través de este túbulo los pulmones se llenan de 1 ml previamente calentada bajo punto de fusión de agarosa (2% w / v, Promega, Mannheim, Alemania), utilizando una jeringa de 1 ml Omnifix (B. Braun). Tan pronto como los pulmones se llenan de la tráquea se ata con un trozo de hilo de coser y todo el animal se coloca en un refrigerador a 4 ° C. 15 minutos más tarde, cuando la agarosa se ha solidificado, todo el pulmón se extirpa a partir de la tráquea. Con un par de tijeras con punta afilada, el lóbulo del pulmón derecho se retira posteriormente, la superficie inferior secar brevemente en una hoja de papel de seda y luego el lóbulo entero está pegado a la preparación de bloques de un vibratome Vibroslice (Campden Instruments, Reino Unido, 752M ) con una gota de adhesivo tisular para la fijación (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania, Roti-Coll 1). Después de 1 min del bloque se ha instalado en la cámara de corte de la vibratome, que está lleno de pre-frío (4 ° C) PBS. El vibratome está en una vibración de gama media (5 de 10 max.) Y también una velocidad moderada (5 de 10 max.) De tal manera que una sección horizontal de lapulmonar se produce. La mitad superior del órgano se transfiere en una pequeña placa de Petri de plástico (5 cm de diámetro) donde se invierte y se fija con una arandela plana hecho a sí mismo (1 cm de diámetro interior), que está cubierto por un conjunto de hilos de nylon en paralelo, cada una de 1 mm de distancia (figura complementaria 3). Por último, la placa de Petri se llena con 10 ml de PBS suplementado con 10 l de ADN tinte Sytox naranja [5 mm] (Invitrogen, Alemania), resultando en una concentración final tinte de 5 micras. 3. 2-fotón láser microscopía La placa de Petri que contiene la muestra de pulmón se instala en el objetivo del microscopio para que el tampón puede ser calentado a 37 ° C por un sensor de temperatura controlada calentador (figura complementaria 4). 2-fotón microscopía A continuación se lleva a cabo sobre la superficie de corte general con un microscopio Zeiss LSM 710 NLO en un escenario vertical Axio forense equipado con un lente de agua 20xNA1.0 inmersión (Zeiss, Jena, Alemania). Para las imágenes, las diferentes áreas a lo largo de la sección se analizan hasta una profundidad de 400 m con una longitud de onda de luz de 800 nm para detectar verde (530 nm) y rojo (580 nm) de fluorescencia, así como la generación de segundo armónico (SHG)-de la señal y la azul calcofluor fluorescencia (en nm de emisión 400-470) con detectores externos no descanned (NDD). Además de imágenes 2-D y las películas de lapso de tiempo (1 imagen cada 5-10 segundos), única o repetitiva de 3 dimensiones pilas de imagen puede ser entregado después de las representaciones voxel o solo las imágenes se enfocan extendida o 4-D de datos (en 3D a través del tiempo), utilizando diferentes paquetes de software. Esta configuración permite la observación microscópica del comportamiento celular en un ambiente casi intacto que, puesto que constituye la puerta de entrada para una variedad de patógenos de transmisión aérea, es de importancia inmunológica enorme. La motilidad celular, la fagocitosis y la producción neta de los neutrófilos después de la infección endógena con el hongo Aspergillus fumigatus puede ser fácilmente investigado bajo estas condiciones in situ. 4. Resultados representante Si se realiza correctamente la imagen va a generar 2 – o 3-color diapositivas o películas. A pesar de colorante se realiza en un procedimiento de post-proceso y por tanto libremente adaptable, por lo general, seleccionar un esquema de colores que refleja el color natural de la tinta / de la señal, la cual es detectada en el canal de relación. Por lo tanto, los tintes Sytox se muestran en rojo, los hongos, así como la señal de los grupos de autoayuda se muestra en azul y, si está presente, EGFP-etiquetados células se tiñen de verde. En el primer ejemplo (Fig. 1) la señal de los grupos de autoayuda azul representa las fibras del tejido de un pulmón no infectados y el rojo de la señal Sytox es producida por los núcleos de las células residentes de pulmón a cielo abierto por el vibratome. En el segundo ejemplo (Fig. 2) un pulmón infectado se muestra, en ambas estructuras, alveolar, así como las masas de hongos, aparecen en azul, mientras que los núcleos y los Nets se tiñen de rojo. El tercer ejemplo (Fig. 3) es de un animal de Lys-EGFP transgénicos, donde además de las estructuras de azul y rojo los neutrófilos verde también puede ser visto. La migración de neutrófilos y su fagocitosis de cada uno de los elementos fúngicos en las secuencias de lapso de tiempo se muestra en la película suplementario. Figura 1. La aparición de un trozo de pulmón no infectadas en dos colores de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón fue preparado a partir de una no infectada C57/BL6 del ratón y la imagen como se describe en el protocolo. Aquí se presentan son la señal de los grupos de autoayuda de la estructura del tejido alveolar (A), la señal Sytox de los núcleos celulares a cielo abierto durante la preparación de la porción de pulmón (B), y una superposición de los dos canales (C). El área del recuadro en (C) se ve ampliada en (D). Tenga en cuenta el tejido fibroso en la parte inferior del pulmón rebanada en comparación con la organización claramente alveolar en las áreas activas de respiración de los pulmones de arriba. Figura 2. La aparición de un trozo de pulmón de un animal infectado Aspergillus tipo salvaje en dos colores de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón de un ratón infectado C57/BL6 7 h antes con A. fumigatus fue preparado y la imagen como se describe en el protocolo. Se muestra la estructura combinada de hongos y los grupos de autoayuda del tejido alveolar (A), la señal de NET Sytox ADN, así como núcleos de las células a cielo abierto durante la preparación de la porción de pulmón (B), y una superposición de los dos canales (C) . El área del recuadro en (C) se ve ampliada en (D). Tenga en cuenta que las áreas claramente diferenciadas de las masas de hongos, los alvéolos, y las estructuras de NET-están marcados con las letras F, A y N, respectivamente. Figura 3. La aparición de un trozo de pulmón de una infección por Aspergillus Lys-EGFP animales en 3-color de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón de ratón Lys-EGFP infectados 7 h antes conA. fumigatus fue preparado y la imagen como se describe en el protocolo. Se muestra la estructura combinada de hongos y los grupos de autoayuda del tejido alveolar (azul), la señal Sytox de los núcleos celulares y redes (rojo), así como numerosos neutrófilos (verde). Adicional Figura 1. La fijación del ratón para la intubación. Bajo ketamina / Rompun anestesia del animal se fija con una banda elástica en los dientes con el fin de facilitar la intubación con un catéter venoso 22G. Complementaria la figura 2. Ventilación mecánica del ratón. El ratón intubados está infectado por una aplicación informática de 1×10 7 esporas se resuspendieron en 100 l de PBS. Una mejora de la distribución de partículas de hongos en el interior del pulmón se logra mecánicamente la ventilación del ratón infectado con un respirador de pequeños animales. Complementaria la figura 3. La fijación del pulmón lóbulo. Después de la preparación del lóbulo del pulmón derecho el órgano se fija en una placa de Petri por el uso de una lavadora de laboratorio hechas plana que está cubierto por un conjunto de hilos de nylon en paralelo. Adicional Figura 4. Dos fotones de imágenes de instalación. La placa de Petri que contiene el lóbulo del pulmón derecho se instala sobre una estera de calefacción bajo el microscopio de 2 fotones después de la adición del ADN tinte Sytox Orange. Suplementario película:. Neutrófilos Los neutrófilos migran y phagocytosing elementos fúngicos en los pulmones infectados por Aspergillus como se ve por lapso de tiempo de 2 fotones microscopía de un trozo de vida de pulmón 7 h después de la infección con el hongo son elementos verdes, hongos y los grupos de autoayuda son de color azul, y los núcleos celulares como NET así como las estructuras se representan en rojo. El tiempo real del experimento se muestra en la parte inferior derecha. La barra de escala representa 50 micras. Haga clic aquí para ver el video