Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

1. Сотовые Окрашивание Подготовка клетки. Клетки должны быть использованы в то же время активно развивается (60 – 80% слияния). Сыворотка голодать клетки на ночь, пластинка их клетки на уровне 0,1 млн. долл. и в 0,5 мл бессывороточной среде в 24-луночного планшета и поместите в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2) в течение 30 минут – 2 часа, чтобы восстановить от трипсинизации. Смешайте первичного и вторичного антитела. Mix (5 мкл первичных анти-GLUT4 антитела с 1 мкл вторичных куриные анти-IgG антител козы конъюгированных с AlexaFluor 488) х количество скважин. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре, в темноте. Подготовка 2X рабочий запас инсулина путем разбавления ее в среду. Убедитесь, что клетки присоединились или нет. Аккуратно добавить 6 мкл смеси антител и 0,5 мл 2 раза ваш рабочий запас инсулина для скважин содержащих клеток. Избегайте любой турбулентности среды. Инкубируйте (37 ° C, 5% СО 2) в течение 30 минут, в темноте. Fix клетки, добавляя 0,5 мл ФСБ + 1% PFA в каждую лунку, без встряхивания клеток. Инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре, в темноте. Если ваши клетки придерживаются скважин, слегка приподнимите их ячейки Колмар. Передача клетки (1 мл общего числа) в пробирки, которые вписываются в ваш проточный цитометр и центрифуга для осаждения клеток. Вымойте гранул в два раза с 1 мл PBS и ресуспендируют в 0,4 мл PBS + 1% PFA. В этот момент клетки могут быть завернуты в фольгу и хранить в холодильнике (4-8 ° С) или приняты для потока цитометр для немедленного сбора данных. 2. Сбор данных Установить широкие ворота вокруг живых клеток в сторону рассеяния (SSC) по сравнению с разбросом вперед (ФТС) панели. Используйте отрицательные трубки (клетки не получавших инсулин или ячейки "окрашенные" с изотипа управления), чтобы установить параметр FL1. Убедитесь, что пик полностью на панели, а не заключать на нижней стороне. Получения данных, по крайней мере 10 000 клеток на трубе. 3. Анализ данных Нарисуйте ворот вокруг живых клеток в SSC против ФСБ панели (рис. 1А). Участок гистограммы AlexaFluor 488 интенсивности флуоресценции от числа клеток в живых-клеток ворот (рис. 1В). Можно наложить различные гистограммы для визуализации различий, но для количественного, определить среднее и медиана интенсивности флуоресценции для каждой ячейки населения и использовать эти номера для Вашего сравнения (рис. 1в). Нормализация данных значения, полученные в отсутствие инсулина, как показано на рисунках 1C и 1D. 4. Представитель Результаты В миобластов изолированы от здорового человека (без резистентности к инсулину), инсулин вызывает дозозависимое транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану (рис. 1, слева). В отличие от этого, инсулин не вызывает GLUT4 транслокации к плазматической мембране миобластов изолированы от больных с резистентностью к инсулину (рис. 1, справа). Рисунок 1. Пример окрашивания эксперимента. Миобластов были изолированы от донора без резистентности к инсулину (слева) и от пациентов с резистентностью к инсулину (справа)., SSC (боковой разброс) по сравнению с FCS (вперед разброс) сюжет с воротами вокруг живых клеток. B, клетки в закрытом , окрашивали антителами против внешних эпитопу GLUT4, и оставил нестимулированных (красный) или стимулированный инсулином 1 нм (синий), 10 нм (оранжевый), или 100 нм (зеленый). Для фигуры ясности, мы показываем только данных без и с 100 нМ инсулина для клеток с резистентностью к инсулину. C, средняя интенсивность флуоресценции (МФО) из гистограммы показаны на В были нормированы на МФО клеток левой нестимулированных (без инсулина). D, Земельные нормализованные данные МФО из гистограммы показан на B.