Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

1. La colorazione delle cellule Preparare le cellule. Le cellule devono essere utilizzati, pur in crescita attiva (60-80 confluenza%). Siero affamare le cellule durante la notte, la piastra loro celle a 0,1 milioni di euro oltre a 0,5 ml di siero-free medio nell'arco di 24 pozzetti e posto nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2) per 30 minuti – 2 ore per il recupero da tripsinizzazione. Mescolare gli anticorpi primari e secondari. Mix (5 ml di primaria anticorpi anti-GLUT4 con 1 ml di pollo secondario di capra anti-IgG coniugato con AlexaFluor 488) x numero di pozzi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, al buio. Preparare uno stock 2X lavoro di insulina da diluire in mezzo. Verificare se le cellule hanno aderito o meno. Mescolare delicatamente aggiungere 6 microlitri di anticorpi e 0,5 ml di vostro stock 2X lavoro di insulina per i pozzetti contenenti le cellule. Evitare qualsiasi turbolenza del mezzo. Incubare (37 ° C, 5% CO 2) per 30 minuti, al buio. Fissare le cellule con l'aggiunta di 0,5 ml di PBS + 1% PFA ad ogni bene, senza tremare le cellule. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, al buio. Se le cellule hanno aderito ai pozzi, delicatamente ascensore con un sollevatore di cellulare. Trasferire le cellule (1 totale ml) in provette che stare in una citometro a flusso e centrifugare per agglomerare le cellule. Lavare il pellet due volte con 1 ml di PBS e risospendere in 0,4 ml di PBS + 1% PFA. A questo punto, le cellule possono essere avvolti in pellicola e conservato in frigorifero (4-8 ° C) o adottate per il citofluorimetro per l'immediata acquisizione dei dati. 2. Acquisizione Dati Impostare un cancello largo intorno alle cellule vivono nel side scatter (SSC) in avanti rispetto a dispersione (FCS) del pannello. Utilizzare un tubo negativo (cellule non trattate con insulina o cellule "colorate" con un controllo isotipo) per impostare il parametro FL1. Assicurarsi che il picco è del tutto nel pannello, non tagliare sul lato inferiore. Acquisire i dati di almeno 10.000 cellule per provetta. 3. Analisi dei dati Disegnare un gate intorno alle cellule vivono nel vs SSC FSC pannello (Figura 1A). Tracciare la istogrammi di AlexaFluor 488 intensità di fluorescenza in funzione del numero di cellule vive all'interno della cellula-gate (Figura 1B). È possibile sovrapporre diversi istogrammi di visualizzare le differenze, ma per la quantificazione, determinare l'intensità media e mediana di fluorescenza per ogni popolazione cellulare e utilizzare questi numeri per i confronti (Figura 1C). Normalizzare i dati al valore ottenuto in assenza di insulina, come mostrato in Figure 1C e 1D. 4. Rappresentante Risultati In mioblasti isolati da un individuo sano (non insulino-resistenza), l'insulina induce una dose-dipendente traslocazione di GLUT4 dal citoplasma alla membrana plasmatica (figura 1, a sinistra). Al contrario, l'insulina non induce traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica di mioblasti isolati da un paziente con insulino-resistenza (figura 1, a destra). Figura 1. Esempio di un esperimento di colorazione. Mioblasti sono stati isolati da un donatore, senza insulino-resistenza (a sinistra) e da un paziente con insulino-resistenza (a destra). A, SSC (scatter laterale) rispetto FCS (forward scatter) trama con un cancello intorno alle cellule vive. B, cellule in gated A, colorate con l'anticorpo contro un epitopo esterno di GLUT4, e di sinistra non stimolate (rosso) o stimolati con insulina 1 nm (blu), 10 Nm (arancione), o 100 nm (verde). Per chiarezza la figura, si limita a mostrare i dati, senza e con 100 nM di insulina per le cellule con insulino-resistenza. C, media intensità di fluorescenza (MFI) degli istogrammi mostrato in B sono stati normalizzati per la MFI delle cellule non stimolate sinistra (non insulina). D, grafici dei dati normalizzati IFM dal istogrammi mostrato in B.