Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

1. Coloration des cellules Préparer les cellules. Les cellules doivent être utilisées tout en pleine croissance (60 – 80% de confluence). Sérum affamer les cellules pendant la nuit, les cellules de la plaque à 0,1 million par puits dans 0,5 ml milieu sans sérum dans une plaque de 24 puits et les placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 min – 2 heures pour récupérer à partir trypsinisation. Mélanger les anticorps primaires et secondaires. Mélanger (5 pi de primaire anti-GLUT4 anticorps avec 1 poulet uL secondaire anti-chèvre anticorps IgG conjugué à AlexaFluor 488) x nombre de puits. Incuber 10 minutes à température ambiante, dans l'obscurité. Préparer un stock de travail de l'insuline 2X en le diluant dans le milieu. Vérifiez si les cellules ont adhéré ou non. Ajouter délicatement 6 mélange d'anticorps uL et 0,5 mL de votre stock de travail 2X de l'insuline dans les puits contenant les cellules. Évitez toute turbulence du milieu. Incuber (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 minutes, dans l'obscurité. Fixer les cellules en ajoutant 0,5 ml de PBS + 1% PFA dans chaque puits, sans secouer les cellules. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante, dans l'obscurité. Si vos cellules ont adhéré aux puits, délicatement les soulever avec un lifter cellule. Transférer les cellules (1 mL au total) dans des tubes qui correspondent à votre cytomètre en flux et centrifuger pour sédimenter les cellules. Laver le culot à deux reprises avec 1 ml de PBS et remettre en suspension dans 0,4 ml de PBS + 1% PFA. À ce stade, les cellules peuvent être enveloppés dans une feuille et de les conserver au réfrigérateur (4-8 ° C) ou prises pour le cytomètre en flux pour l'acquisition de données immédiates. 2. Acquisition de données Régler une porte large autour des cellules vivantes dans la diffusion latérale (SSC) par rapport à l'avant de dispersion (FCS) du panneau. Utiliser un tube négatif (cellules non traitées à l'insuline ou des cellules "taché" avec un contrôle isotypique) pour définir votre paramètre FL1. Assurez-vous de pointe est complètement dans le panneau, pas couper sur le côté inférieur. Acquérir des données provenant d'au moins 10 000 cellules par tube. 3. Analyse des données Dessinez une porte autour des cellules vivent dans le panneau CSS vs FSC (figure 1A). Tracer les histogrammes de 488 AlexaFluor intensité de fluorescence en fonction du nombre de cellules dans la porte des cellules vivantes (figure 1B). Vous pouvez superposer des histogrammes différents de visualiser les différences, mais pour la quantification, de déterminer l'intensité moyenne et la médiane de fluorescence pour chaque population de cellules et d'utiliser ces numéros pour vos comparaisons (figure 1C). Normaliser les données de la valeur obtenue en l'absence d'insuline, comme indiqué dans les figures 1C et 1D. 4. Les résultats représentatifs Dans les myoblastes isolés d'un individu sain (pas de résistance à l'insuline), l'insuline induit une translocation dose-dépendante de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique (Figure 1, gauche). En revanche, l'insuline ne pas provoquer la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique des myoblastes isolés à partir d'un patient avec résistance à l'insuline (Figure 1, droite). Figure 1. Exemple d'une expérience de coloration. Myoblastes ont été isolés à partir d'un donneur sans résistance à l'insuline (à gauche) et chez un patient insulino-résistance (à droite). A, SSC (Side Scatter) versus FCS (forward scatter) parcelle avec une porte autour des cellules vivantes. B, les cellules fermées en Un, colorées avec l'anticorps contre un épitope externe de GLUT4, et de gauche non stimulées (rouge) ou stimulées par l'insuline 1 nm (bleu), 10 nm (orange), ou 100 nm (vert). Pour plus de clarté la figure, nous ne montrons données sans et avec 100 nM d'insuline pour les cellules insulino-résistance. C, les intensités moyennes de fluorescence (MFI) des histogrammes montré en B ont été normalisées à l'IMF des cellules non stimulées gauche (pas d'insuline). D, tracés des données normalisées de l'IMF histogrammes montré en B.