Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie
Summary
Dit protocol beschrijft een snelle techniek om de translocatie van GLUT4 kwantificeren van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie.
Abstract
Glucose is de belangrijkste bron van energie voor het lichaam, waarvoor een constante regulatie van de bloedconcentratie. De afgifte van insuline door de alvleesklier veroorzaakt glucose-opname door insuline-gevoelige weefsels, met name de hersenen, skeletspieren, en adipocyten. Patiënten die lijden aan type-2 diabetes en / of obesitas ontwikkelen vaak insulineresistentie en niet in staat zijn om hun glucose-homeostase te controleren. Nieuwe inzichten in de mechanismen van insulineresistentie kunnen voorzien in nieuwe behandelingsstrategieën voor type-2 diabetes.
De GLUT familie van glucose transporters bestaat uit dertien leden verdeeld over de verschillende weefsels in het hele lichaam een. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is de belangrijkste vervoerder dat bemiddelt glucose-opname door insuline gevoelige weefsels, zoals de skeletspieren. Na binding van insuline aan zijn receptor, blaasjes waarin GLUT4 uit het cytoplasma transloceren naar de plasmamembraan, het induceren van de opname van glucose. Verminderde GLUT4 translocatie is een van de oorzaken van insulineresistentie bij type-2 diabetes 2,3.
De translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar de plasma membraan kan worden gevisualiseerd door middel van immunocytochemie, met behulp van fluorofoor-geconjugeerd GLUT4-specifieke antilichamen.
Hier beschrijven we een techniek om de totale hoeveelheid GLUT4 translocatie kwantificeren van de plasmamembraan van de cellen tijdens een gekozen duur, met behulp van flow cytometrie. Dit protocol is snel (minder dan 4 uur, inclusief incubatie met insuline) en laat de analyse van zo weinig als 3000 cellen of zo veel als 1 miljoen cellen per aandoening in een enkel experiment. Zij beroept zich op anti-GLUT4 antilichamen die zijn gericht op een externe epitoop van de vervoerder die zich binden aan het zo snel als het is blootgesteld aan de extracellulaire medium na translocatie naar de plasmamembraan.
Protocol
Discussion
We hebben aangetoond dat een snelle techniek voor het kwantificeren van de translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie.
GLUT4 is slechts tijdelijk tot uitdrukking in de plasmamembraan van cellen en is endocytosed. Omdat de gebonden antilichamen gehecht blijven aan de GLUT4, zelfs tijdens endocytose, de fluorescentie-signaal geeft de totale hoeveelheid GLUT4, dat was bij de plasmamembraan blootgesteld tijdens de gekozen duur van de incubatie in de aanwezigheid van insuline.
Deze techniek kan ook toegepast worden op het bestuderen van de translocatie van andere eiwitten uit een intracellulaire compartiment van de plasmamembraan, mits een goede antilichaam gericht op een externe epitoop van het eiwit van belang is beschikbaar. Bijvoorbeeld, is een soortgelijke test nu vaak gebruikt om de snelheid van degranulatie van cytotoxische T-lymfocyten en natural killer lymfocyten te beoordelen door het meten van de translocatie van CD107a om hun plasmamembraan 4,5. De translocatie van fosfatidylserine vanaf de binnenzijde van de plasma membraan naar de buitenzijde tijdens cel apoptose of necrose kan ook worden gedetecteerd door middel van flowcytometrie, met behulp van fluorofoor-gelabeld annexine V 6.
Naast snelheid van de test, flow cytometrie presenteert het voordeel dat de studie van proteïne translocatie naar de plasmamembraan in gemengde celpopulaties. Inderdaad, kan men combineren kleuring voor cel subset markers en voor het eiwit van belang, gevolgd door de data-acquisitie op een multi-laser flowcytometer 7.
De bedragen van antilichamen in paragraaf 1.2 van het protocol zijn een uitgangspunt, raden wij u aan uw antistoffen titreer met je cellen van belang zijn voor de minimum antilichaamconcentratie dat geeft je een maximale signaal te bepalen. Een goed uitgangspunt bereik van de primaire anti-humane antilichaam GLUT4 we hier hebben gebruikt zou 10 tot 10 pi per buis (dat wil zeggen 0,2-2 ug antilichaam per tube), elke buis met niet meer dan 1 miljoen cellen zijn. Voor andere primaire antilichamen, de instructies van de leverancier.
Normalisatie van gegevens is noodzakelijk als autofluorescentie van de cellen zal variëren van donor tot donor en van experiment om te experimenteren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de mevrouw Clifford Elder White Graham Bijzonder Onderzoeksfonds en het NIH (AR059838) naar CB, van de NIH (AR052791, AR044387-ARRA, & NS063298) om LTT, en door het Baylor College of Medicine Cytometry en Cell Sorting Core met financiële steun van de NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, en NCI P30CA125123). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 | |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | ||
| Recombinant human insulin | Sigma | I2643 | ||
| Cell lifters | VWR | 29942-118 | Cut to fit the wells | |
| 5 ml tubes for FACS | VWR | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
