フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

1。細胞の染色細胞を準備します。それでも積極的に（ – 80％コンフルエント60）成長中の細胞を使用する必要があります。回復するために2時間-血清は、一晩30分間インキュベーター内で24ウェルプレートと場所に0.5 mLの無血清培地（37℃、5％CO 2）にも当たり0.1万でプレートそれらの細胞を細胞を飢えさせるトリプシン処理から。 一次および二次抗体を混ぜる。ミックス（AlexaFluor 488コンジュゲート1μL二次ニワトリ抗ヤギIgG抗体と一次抗GLUT4抗体の5μL）井戸のx数。暗闇の中で、室温で10分間インキュベートする。 培地で希釈してインスリンの2X作業用ストックを準備します。 細胞が付着したかしていないかどうかを確認します。 穏やかに細胞を含むウェルにインスリンのご2X作業用ストックの6μL抗体ミックスと0.5 mLを加える。培地のいずれかの乱流を避けてください。暗所で30分間インキュベート（37℃、5％CO 2）、。 細胞を振盪せずに、各ウェルにPBS + 1％PFAの0.5 mLを加えることによって細胞を固定する。暗闇の中で、室温で20分間インキュベートする。 あなたの細胞がウェルに付着している場合は、軽く細胞リフターでそれらを持ち上げます。あなたのフローサイトメーターに適合して細胞をペレット化する遠心チューブに細胞を（1 mLの合計）に転送します。 0.4 mLのPBS + 1％PFAで1 mLのPBSに懸濁するで二回ペレットを洗浄します。この時点で、細胞はホイルでラップすることができますし、冷蔵庫に保存されている（4-8 ° C）または即時のデータ取得のためのフローサイトメーターに撮影。 2。データ収集側方散乱光（SSC）に対する前方散乱光（FCS）パネルで、生細胞の周り広範なゲートを設定します。おFL1パラメータを設定するには、負のチューブを（アイソタイプコントロールとインスリンや細胞で処理していない細胞"ステンドグラス"）を使用してください。あなたのピークは、パネルで完全に下側のカットではないことを確認してください。 チューブごとに少なくとも10,000個の細胞からデータを取得する。 3。データ解析 SSC VS FSCパネル（図1A）で生細胞の周りにゲートを描きます。 AlexaFluor 488蛍光強度に対する生細胞ゲート内の細胞（図1B）の数のヒストグラムをプロット。あなたは（図1C）の違いを視覚化する別のヒストグラムをオーバーレイが定量のために、各細胞集団の平均値と中央値蛍光強度を判断し、比較のためにこれらの番号を使用することができます。 として図の1Cと1Dに示すようにインスリンの非存在下で得られた値にデータを正規化する。 4。代表的な結果健常者（無インスリン抵抗性）から分離された筋芽細胞で、インスリンは細胞質から形質膜（図1、左）へのGLUT4の用量依存性の転座を誘発する。対照的に、インスリンは、インスリン抵抗性（図1、右）の患者から分離された筋芽細胞の形質膜へのGLUT4トランスロケーションを誘導しない。 図1。染色実験の例。の筋芽細胞がインスリン抵抗性のないドナー（左）からとインスリン抵抗性（右）患者から分離された。生細胞の周りのゲートと、SSC（側方散乱光）に対するFCS（前方散乱）プロット。B、セルはゲート、GLUT4の外部エピトープに対する抗体で染色し、そして非刺激左（赤）またはインスリン1nMの（青）、10nMの（オレンジ）、または100 nm（緑）で刺激した。図をわかりやすくするために、我々は唯一、C。インスリン抵抗性を持つ細胞に100 nMのインスリンなしとでデータを表示Bに示すようにヒストグラムの蛍光強度（MFI）の平均（無インシュリン）非刺激のまま細胞のMFIに標準化した。 D、Bに示すように、ヒストグラムから正規化されたMFIのデータのプロット