La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

1. La tinción de células Prepare las células. Las células deben ser utilizados al mismo tiempo en activo crecimiento (60 – 80% de confluencia). Suero de comer a las células durante la noche, las células de la placa de ellas de 0,1 millones de dólares y en 0,5 ml de medio libre de suero en una placa de 24 pozos y colocar en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 30 minutos – 2 horas para recuperarse de tripsina. Mezclar los anticuerpos primarios y secundarios. Mix (5 L de primaria de anticuerpos anti-GLUT4 con 1 l de pollo secundario de cabra anti-IgG conjugado con AlexaFluor 488) x número de pozos. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Prepare una acción 2X de trabajo de la insulina mediante la dilución en medio. Comprobar si las células se han adherido o no. Suavemente agregar la mezcla de anticuerpos l 6 y 0,5 ml de 2X sus acciones de trabajo de la insulina para los pozos que contienen las células. Evitar cualquier turbulencia del medio. Incubar (37 ° C, 5% CO 2) durante 30 minutos, en la oscuridad. Fijar las células mediante la adición de 0,5 ml de PBS + 1% PFA en cada pocillo, sin agitar las células. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Si las células se han adherido a los pozos, suavemente levantar con una grúa móvil. Transferencia de las células (1 ml en total) en los tubos que caben en el citómetro de flujo y se centrifuga para sedimentar las células. Lavar el precipitado dos veces con 1 ml de PBS y se resuspenden en 0,4 ml de PBS + 1% PFA. En este punto, las células pueden ser envueltos en papel de aluminio y se almacena en el refrigerador (4-8 ° C) o llevado al citómetro de flujo para la adquisición de datos inmediata. 2. Adquisición de Datos Establecer una puerta amplia en torno a las células vivas en la dispersión lateral (SSC) en comparación con el panel delantero de dispersión (FCS). Use un tubo negativo (células no tratadas con insulina o las células "manchado" con un control de isotipo) para establecer el parámetro FL1. Asegúrese de que su pico está completamente en el panel, no se cortan en la parte inferior. Adquisición de datos de al menos 10.000 células por tubo. 3. Análisis de Datos Dibuja una puerta alrededor de las células vivas en la cooperación Sur-Sur vs FSC panel (fig. 1A). Parcela los histogramas de 488 AlexaFluor intensidad de fluorescencia en función del número de células dentro de la puerta de células vivas (fig. 1B). Se puede superponer diferentes histogramas para visualizar las diferencias, sino para cuantificar, determinar la intensidad de fluorescencia media y la mediana para cada población de células y utilizar estos números para su comparación (fig. 1C). Normalizar los datos con el valor obtenido en ausencia de insulina, como se muestra en las figuras 1C y 1D. 4. Resultados representante En mioblastos aislados de un individuo sano (sin resistencia a la insulina), la insulina provoca una translocación dependiente de la dosis de GLUT4 desde el citoplasma a la membrana plasmática (Figura 1, izquierda). Por el contrario, la insulina no induce la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática de mioblastos aislados de pacientes con resistencia a la insulina (Figura 1, derecha). Figura 1. Ejemplo de un experimento de tinción. Mioblastos fueron aisladas de un donante sin resistencia a la insulina (izquierda) y de un paciente con resistencia a la insulina (derecha). A, SSC (dispersión lateral) frente a FCS (forward scatter) parcela con una verja alrededor de las células vivas. B, células cerradas en A, teñidas con el anticuerpo contra un epítopo externo de GLUT4, y dejó sin estimular (rojo) o estimuladas con insulina 1 nm (azul), 10 nM (naranja), o 100 nm (verde). Para mayor claridad, la figura, sólo se muestran los datos con y sin insulina 100 nM para las células con resistencia a la insulina. C, media de intensidad de fluorescencia (MFI) de los histogramas se muestra en la B se normalizaron a la IMF de las células sin estimular la izquierda (no insulina). D, Parcelas de la normalización de datos de las IFM de los histogramas se muestra en la B.