Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

1. A coloração de células Prepare as células. As células devem ser usados ​​ao mesmo tempo crescendo ativamente (6-80 confluência%). Soro fome as células durante a noite, as células da placa-los em 0,1 milhões por poço em 0,5 mL meio isento de soro em uma placa de 24 poços e colocar na incubadora (37 ° C CO, 5% 2) por 30 min – 2 horas para se recuperar de tripsinização. Misture os anticorpos primário e secundário. Mix (5 mL de anticorpos anti-GLUT4 primária com uma secundária de frango mL anti-IgG de cabra conjugado com AlexaFluor 488) x número de poços. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Prepare um estoque 2X de trabalho da insulina, diluindo-o em médio prazo. Verifique se as células aderiram ou não. Delicadamente adicionar 6 mL mix de anticorpos e 0,5 mL de seu estoque de insulina 2X trabalhar aos poços contendo as células. Evitar qualquer turbulência do meio. Incubar (37 ° C, 5% CO 2) por 30 minutos, no escuro. Fixar as células, adicionando 0,5 mL de PBS + PFA 1% a cada poço, sem agitar as células. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Se suas células aderiram aos poços, levantar delicadamente os com um levantador de células. Transferência de células (1 total mL) em tubos que se encaixam na sua citômetro de fluxo e centrifugar para agregar as células. Lave o pellet duas vezes com 1 mL de PBS e ressuspender em 0,4 mL de PBS + 1% PFA. Neste ponto, as células podem ser embrulhados em papel alumínio e armazenados na geladeira (4-8 ° C) ou levado para o citômetro de fluxo para aquisição de dados imediatos. 2. Aquisição de Dados Definir uma porta ampla em torno das células vivem na dispersão lateral (SSC) versus dispersão frente do painel (FCS). Use um tubo negativo (células não tratadas com insulina ou células "manchado" com um controle de isotipo) para definir o parâmetro FL1. Verifique se o seu pico é completamente no painel, não cortados no lado inferior. Aquisição de dados de pelo menos 10 mil células por tubo. 3. Análise de Dados Desenhar uma porta em torno das células vivem no SSC FSC vs painel (Figura 1A). Plotar os histogramas de intensidade AlexaFluor 488 fluorescência versus número de células dentro do portão live-celular (Figura 1B). Você pode sobrepor histogramas diferentes de visualizar as diferenças, mas para a quantificação, determinar a intensidade média e mediana de fluorescência para cada população de células e usar esses números para o seu comparações (Figura 1C). Normalizar os dados para o valor obtido na ausência de insulina, como mostrado nas Figuras 1C e 1D. 4. Resultados representante Em mioblastos isolado de um indivíduo saudável (sem resistência à insulina), a insulina induz a uma translocação dose-dependente de GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática (Figura 1, esquerda). Em contraste, a insulina não induz a translocação do GLUT4 para a membrana plasmática dos mioblastos isolado de um paciente com resistência à insulina (Figura 1, à direita). Figura 1. Exemplo de um experimento de coloração. Mioblastos foram isolados de um doador sem resistência à insulina (esquerda) e de um paciente com resistência à insulina (direita). A, SSC (Side Scatter) versus FCS parcela (para a frente de dispersão) com uma porta em torno da formação de células vivas. B, células gated em A, coradas com o anticorpo contra um epítopo externa do GLUT4, e deixou unstimulated (vermelho) ou estimuladas com insulina 1 nM (azul), 10 nm (laranja), ou 100 nM (verde). Para maior clareza a figura, só mostram dados sem e com 100 nM de insulina para as células com resistência à insulina. C, média intensidade de fluorescência (IMF) da histogramas mostrados na B foram normalizados para a IMF das células não estimuladas esquerdo (não insulina). D, Plots dos dados normalizados IFM da histogramas mostrados na B.