Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

1. Zellfärbung Bereiten Sie die Zellen. Die Zellen sollten verwendet werden, während immer noch aktiv wachsende (60 bis 80% Konfluenz) werden. Serum hungern die Zellen über Nacht, Teller ihnen Zellen bei 0,1 Millionen pro Well in 0,5 ml serum-freiem Medium in einer 24-Well-Platte und in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 30 min – 2 Stunden zu erholen von Trypsinierung. Mischen Sie die primären und sekundären Antikörper. Mix (5 ul des primären anti-GLUT4 Antikörper mit 1 ul sekundären Huhn anti-Ziege IgG-Antikörper, konjugiert mit AlexaFluor 488) x Anzahl der Brunnen. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Bereiten Sie eine 2X arbeiten Lager von Insulin durch Verdünnen in Medium. Prüfen Sie, ob die Zellen eingehalten haben oder nicht. Gently add 6 ul Antikörper-Mix und 0,5 mL von 2X arbeiten Bestand an Insulin, um den Brunnen mit den Zellen. Vermeiden Sie jegliche Turbulenzen des Mediums. Inkubieren (37 ° C, 5% CO 2) für 30 Minuten im Dunkeln. Fix die Zellen durch Zugabe von 0,5 ml PBS + 1% PFA in jede Vertiefung, ohne Schütteln der Zellen. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Wenn Ihre Zellen in die Vertiefungen haften geblieben sind, heben sie mit einer Zelle Heber. Übertragen Sie die Zellen (1 ml gesamt) in Röhrchen, die in Ihrem Durchflusszytometer fit und Zentrifuge die Zellen zu pelletieren. Waschen Sie die Pellet zweimal mit 1 mL PBS resuspendieren und in 0,4 ml PBS + 1% PFA. An dieser Stelle Zellen können in Folie gewickelt und im Kühlschrank aufbewahrt (4-8 ° C) oder getroffen werden, um das Durchflusszytometer für die sofortige Datenerfassung. 2. Data Acquisition Legen Sie ein breites Tor in die lebenden Zellen in der side scatter (SSC) versus forward scatter (FCS) Panel. Verwenden Sie einen negativen Rohr (Zellen, die nicht mit Insulin oder Zellen "befleckt" mit einem Isotyp-Kontrolle) behandelt, um Ihre FL1-Parameter. Vergewissern Sie sich, Gipfel ist vollständig in das Panel, nicht auf der unteren Seite abgeschnitten. Erwerben Sie Daten von mindestens 10.000 Zellen pro Röhrchen. 3. Data Analysis Zeichnen Sie einen Schutzzaun um die lebenden Zellen in der SSC vs FSC-Panel (Abbildung 1A). Zeichnen Sie die Histogramme der AlexaFluor 488 Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Anzahl von Zellen innerhalb des Live-cell-Tor (Abbildung 1B). Sie können Overlay verschiedenen Histogramme, um Unterschiede zu visualisieren, sondern für die Quantifizierung, die mittlere und die mediane Fluoreszenzintensität für jede Zelle Bevölkerung und der Nutzung dieser Nummern für Ihre Vergleiche (Abbildung 1C). Normalisieren der Daten, um den Wert in Abwesenheit von Insulin erhalten, wie in den Abbildungen 1C und 1D gezeigt. 4. Repräsentative Ergebnisse In Myoblasten aus einem gesunden Menschen (keine Insulinresistenz) isoliert, induziert Insulin eine Dosis-abhängige Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran (Abb. 1, links). Im Gegensatz dazu wird Insulin nicht induzieren GLUT4 Translokation an die Plasmamembran von Myoblasten von einem Patienten mit Insulinresistenz (Abbildung 1, rechts) isoliert. Abbildung 1. Beispiel für eine Färbung zu experimentieren. Myoblasten wurden von einem Spender, ohne Insulin-Resistenz (links) und von einem Patienten mit Insulinresistenz (rechts) isoliert. A, SSC (side scatter) versus FCS (forward scatter) Grundstück mit einem Tor in die lebenden Zellen. B, gated Cells in A, mit dem Antikörper gegen ein externes Epitop des GLUT4 gefärbt, und links unstimulierten (rot) oder mit Insulin stimuliert 1 nM (blau), 10 nM (orange) oder 100 nm (grün). Für Figur Klarheit, zeigen wir nur Daten ohne und mit 100 nM Insulin für die Zellen mit einer Insulinresistenz. C, mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) der Histogramme in B gezeigt wurden, die MFI der Zellen normalisiert links unstimulierten (kein Insulin). D, Plots der normalisierten MFI Daten aus der Histogramme in B gezeigt