Debido a su gran tamaño y organización relativamente simple, las células enfermeras de Drosophila son ideales para estudios de imágenes de células vivas. Este video describe un método de microinjección para la entrega de compuestos exógenos en las células, y el protocolo destacado demuestra el procedimiento con sondas de oligonucleótidos fluorescentes llamadas balizas moleculares (MBs) utilizadas para visualizar transcripciones endógenas de ARNm.
Protocol
Este protocolo se extrae de Catrina et al., Visualizando y rastreando mRNAs endógenas en cámaras de huevos Drosophila melanogaster en vivo, J. Vis. Exp. (2019). 1. Diseño de MBs para imágenes de células en vivo Doble la secuencia de ARN de destino para predecir la estructura secundaria del objetivo de ARNm utilizando el “formulario de ARN” del servidor mfold (<a href="http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form" target="_…
Materials
Spectrofluorometer
Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon
n/a
Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette
Fireflysci (former Precision Cells Inc.)
701MFL
Dumont #5 tweezer
World Precision Instruments
501985
Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700
Sigma-Aldrich
H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm
VWR
48393-048
Dissecting microscope
Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.
n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad
Genesee Scienific
59-114
Tris-HCL pH 7.5
Sigma-Aldrich
1185-53-1
Magnesium chloride
Sigma-Aldrich
7791-18-6
NaCl
Sigma-Aldrich
7647-14-5
Spinning disc confocal microscope
Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.
n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera
Hamamatsu
n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator
Eppendorf Inc.
920000037
FemtoJet Microinjector
Eppendorf Inc.
920010504
Injection needle: Femtotips II
Eppendorf Inc.
930000043
Loading tip: 20 μL Microloader
Eppendorf Inc.
930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm
VWR
48393-026; 48393-172
Dry yeast
Any grocery store
n/a
Computer, > 20 GB RAM
Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing