Vanwege hun grote omvang en relatief eenvoudige organisatie zijn drosophila-verpleegkundige cellen bij uitstek geschikt voor live celbeeldvormingsstudies. Deze video beschrijft een micro-injectiemethode voor de levering van exogene verbindingen in de cellen, en het aanbevolen protocol demonstreert de procedure met fluorescerende oligonucleotide-sondes genaamd moleculaire bakens (MB’s) die worden gebruikt om endogene mRNA-transcripties te visualiseren.
Protocol
Dit protocol is ontleend aan Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogene mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019). 1. Ontwerp van MB’s voor Live Cell Imaging Vouw de doel-RNA-reeks om de secundaire structuur van het mRNA-doel te voorspellen met behulp van het “RNA-formulier” van de mfold-server (http://unafold.rna.albany….
Materials
Spectrofluorometer
Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon
n/a
Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette
Fireflysci (former Precision Cells Inc.)
701MFL
Dumont #5 tweezer
World Precision Instruments
501985
Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700
Sigma-Aldrich
H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm
VWR
48393-048
Dissecting microscope
Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.
n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad
Genesee Scienific
59-114
Tris-HCL pH 7.5
Sigma-Aldrich
1185-53-1
Magnesium chloride
Sigma-Aldrich
7791-18-6
NaCl
Sigma-Aldrich
7647-14-5
Spinning disc confocal microscope
Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.
n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera
Hamamatsu
n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator
Eppendorf Inc.
920000037
FemtoJet Microinjector
Eppendorf Inc.
920010504
Injection needle: Femtotips II
Eppendorf Inc.
930000043
Loading tip: 20 μL Microloader
Eppendorf Inc.
930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm
VWR
48393-026; 48393-172
Dry yeast
Any grocery store
n/a
Computer, > 20 GB RAM
Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing