Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Zebrafish criação Peixe-zebra são alojados e criados de acordo com métodos padronizados 1. Passado o período tardio larval, o estágio de desenvolvimento de um peixe-zebra pode ser medido pelo seu comprimento padrão (SL), ou a distância em linha reta em milímetros do ponto anteriormost do lábio superior para a base da nadadeira caudal (placa hypural posteriormost) 2. Em aproximadamente um mês após a fertilização (10-12 mm SL), o barbos nasal e maxilar aparecer como transparente brotos epiteliais perto do pits olfativa e nos cantos posterior da maxila, respectivamente. Como o peixe-zebra amadurece, a estender-se barbos estreito, whisker-como apêndices. Porque o barbo maxilar é maior (2-3 mm) e mais fácil de manipular, nosso protocolo aplica-se somente a este apêndice particular; técnicas semelhantes, no entanto, poderia ser adaptada para o menor nasal barbos. Clipping Barbel Anestesiar zebrafish adulto na fase desejada (por exemplo., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 meses pós-fertilização) por imersão em 0,015% MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato) tamponada a 7,0 pH em água do sistema. Observe os movimentos até parar de nadar e ventilação branquial torna-se lenta e regular. Dependendo do tamanho do peixe, anestesia completa demora cerca de 05/02 minutos. Usando um arrastão aquário, peixes de transferência de 1-3 em um momento de um pedaço dobrado de papel toalha molhada em uma placa de Petri. Usando uma espátula sem corte, orientar o peixe assim que são paralelos uns aos outro lado e lateral esquerdo para cima. Parte dobra da toalha de papel molhado sobre a parte caudal do peixe, cobrindo todo o corpo até o opérculo (guelra cobre) para manter a pele e as guelras úmidas durante o procedimento. Ver a placa de Petri sob estereomicroscópio, utilizando-se de baixo ângulo de luz incidente para iluminar a região da cabeça. Foco na base do barbo maxilar esquerdo, que se projeta a partir do canto posterior ventral da maxila (Fig. 1). Figura 1. Firmemente segure o eixo do barbo ligeiramente para a extremidade distal da maxila. Elevar o eixo barbo e inserir as mandíbulas de uma tesoura de ponta fina de primavera apenas proximal ao fórceps. A tesoura pode ser tocado com a pinça para a estabilidade. Deslize as mandíbulas da tesoura ao longo do eixo do barbo até que a ponta se aproxima da borda da maxila. Fechar a tesoura para cortar através do eixo barbos. O barbo amputada, ainda agarrado na pinça, pode ser removido para a fixação ou observação posterior. Transferir imediatamente o peixe para um pequeno tanque de água sistema limpo (~ 500 mL) contendo uma gota de azul de metileno para controlar a infecção fúngica superficial. Permitir que o peixe se recuperar durante a noite. Na manhã seguinte, devolver o peixe para o sistema de criação. Barbel regeneração é máxima após 2 semanas. Incorporação de Agar Pares Barbel Coletar peixes pela técnica apropriada a eutanásia e fixar em um tubo de 50 mL de paraformaldeído 4% tampão fosfato (PBS) com agitação a 4 ° C durante a noite. O volume de fixador deve ser pelo menos dez vezes o volume do tecido. Após a fixação, descarte de resíduos paraformaldeído em um recipiente aprovado e lavar o tecido completamente em diversas mudanças de PBS. Prepare em um mL de vidro 250 ml frasco 150 de 2% agarose (T m ~ 37 ° C) em água destilada. Calor com um microondas ou chapa quente, agitando periodicamente até que esteja completamente dissolvido. Equilibrar a solução fundida em um banho de água 50-60 ° C. Montar um equipamento de eletroforese em gel padrão, colocando um molde de gel vedado pequena (10 x 10 cm; ~ 100 mL de volume gel) firmemente contra os lados da câmara de buffer. Adicionar 2-4 pequena amostra pentes de dentes (4 x 1,5 mm). Sobre uma superfície plana, coloque a agarose derretida no molde para cobrir apenas a base dos favos, formando poços muito superficial. Imediatamente coloque a agarose sobra volta para o banho de água morna, que será usado posteriormente para incorporar o tecido (Passos 9-12). Coloque um copo longo Pasteur pipeta no frasco para manter a pipeta para a mesma temperatura que a agarose. Permita que o gel para endurecer por 20-30 minutos. Remover os favos, em seguida, retire o molde gel contendo o gel endurecido da câmara de buffer. Firmemente a fita lados abertos do molde gel com fita de laboratório para que o gel não deslize para fora. Esta fita deve se estender vários milímetros sobre a superfície do agarose para que agarose adicionais podem ser adicionados mais tarde (Passo 13). Posicione o molde de gel no palco de um estereomicroscópio. Ampliar um poço vazio e trazer as bordas em foco. Sobre a superfície do agarose ao lado do bem, pipetar uma gota de água ou tampão contendo os espécimes fixos barbo (por exemplo, regenerar, e controle). Using dobrados pinos de insetos, arraste as amostras úmidas para dentro do poço e empurrá-los para o fundo. Orientar o barbo eixos paralelos um ao outro e alinhados contra oposto bordas longas do poço. Tensão superficial vai ajudar a segurar o tecido na posição. Quando estiver pronto para incorporar, use uma ponteira fina ou o canto de um tecido de laboratório para remover o excesso de fluido do poço. Trabalhar rapidamente para não deixar o tecido secar. Usando a pipeta Pasteur de vidro aquecido, gentilmente pipeta fresco agarose derretida e em torno da espécimes para selar o tecido barbo no lugar. Não encha demais. Antes da agarose endurece, fazer adaptações de última hora com os pinos de insetos. Coloque uma etiqueta numerada exemplar de papel ao lado do bem e prenda-o com uma pequena gota de agarose. Repita os passos 6 a 10 para cada poço de espécimes. Se desejar para a calibração da imagem, inserir um pedaço de papel com uma escala micrométrica impressos (por exemplo, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) no fundo de um poço vazio. Achatar o papel para o fundo do poço e cobri-lo com agarose quente. Depois de todos os espécimes são incorporados, a superfície do gel será irregular, com gotas de agarose endurecido. Coloque o gel sobre uma superfície plana e gentilmente despeje adicionais agarose derretida até a superfície superior é uniforme. Use a menor quantidade de agarose necessário para obter uma superfície lisa; muito agarose vai obscura de luz de transmissão fotografia. Permitir que esta camada superior para endurecer. O gel pode agora ser fotografado no palco de um estereomicroscópio para registrar morfologia bruta para cada par de barbo. Calibração da imagem é obtida por fotografar a escala micrométrica incorporado. O gel inteiro pode ser armazenado envolto em toalhas de papel molhado e selado em um saco plástico a 4 ° por várias semanas. Para posterior análise, blocos de ágar contendo par casado de barbos podem ser cortadas do gel com uma lâmina de bisturi ou navalha e processados ​​para exame histológico de parafina ou cryosectioning por métodos padrão 3,4. Alternativamente, barbos individuais podem ser dissecados fora da agarose com agulhas finas, lavadas em água, e processados ​​para outras aplicações a jusante (por exemplo, imuno-histoquímica todo-mount ou microscopia confocal).