طرق لدراسة بربل الفكين اسماك الزرد
Summary
في الفك العلوي الزرد بربل هو هيئة المعنى غلافي تحتوي الأدمة ، أرومية متوسطة ومشتقاتها قمة العصبية. الأهم من ذلك ، يمكن تجديد بربل الكبار بعد بتر القريبة. يقدم هذا الفيديو الفك العلوي بربل التنمية ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد ، تليها التصوير جمع ودمج والمصب من العينات باربيل.
Abstract
Barbels والزوائد الجلدية الحسية الموجودة في الأسماك والزواحف والبرمائيات. والزرد ، دانيو rerio وتطوير اثنين من أزواج من barbels – زوجا الأنف القصير وزوج يعد الفك العلوي. بربل الأنسجة يحتوي على خلايا الأدمة ، وأديمي متوسطي المنشأ العصبية العرف ، بما في ذلك خلايا الجلد والغدد وبراعم الذوق ، الخلايا الصباغية ، الأوعية الدموية والاعصاب الحسية. خلافا لمعظم أنسجة البالغين ، وبربل الفك العلوي واضح بصريا ، مما يسمح لنا تصور تطوير وصيانة هذه أنواع الأنسجة في جميع مراحل الحياة.
هذا الفيديو يبين التطور المبكر للبربل الفك العلوي (بداية شهر واحد تقريبا بعد الإخصاب) ، ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد في أطرافهم الكبار (> 3 أشهر بعد الإخصاب). باختصار ، هو ارتفاع في بربل الفك العلوي الأيسر من سمكة تخدير مع ملقط معقم القاصي فقط إلى الحافة الذيلية للفك العلوي. يتم وضع غرامة ، مقص الربيع العقيمة ضد ملقط لخفض رمح بربل على هذا المستوى ، وإنشاء المعالم التشريحية للطائرة البتر. ويمكن قياس النمو التجديدي مع الاحترام لهذه الطائرة ، وبالمقارنة مع بربل المقابل. بربل الأنسجة تتجدد بسرعة ، وقد يصل الحد الأقصى إعادة نمو في حدود 2 اسابيع من الاصابة.
تقنيات لتحليل مجدد بربل تشمل تشريح وتضمينها أزواج متماثلة لbarbels (تجديد والسيطرة) في الآبار من هلام DNA الكهربائي القياسية. يتم تصويرها بسهولة العينات جزءا لا يتجزأ من تحت stereomicroscope عن مورفولوجيا الإجمالي وقياس الأشكال ، ويمكن تخزينها لمدة أسابيع قبل التطبيقات المصب مثل الأنسجة البارافين ، cryosectioning ، و / أو كليا جبل المناعية. هذه الأساليب إنشاء بربل الفك العلوي كما في رواية نظام الأنسجة الحية لدراسة القدرة على التجدد من أنواع خلايا متعددة في سياق الجيني للالزرد.
Protocol
Discussion
في الفك العلوي الزرد بربل هو نظام الأنسجة غير المستغلة لدراسة النمو وصيانة وتجديد العديد من أنواع الخلايا في الزرد. على الرغم من أن ليس لديه ذيل بربل التناظرية الإنسان ، والحفاظ عاليا أنواع الخلايا التي يحتوي عليها ، مما يجعل من الممكن دراسة الجلد والغدد والأوعية الدموية الصباغية ، والأعصاب في بنية أسطوانية واضحة وبسيطة بصريا تشريحيا. مشابهة للزعنفة الذيلية مدروسة ، ويمكن أن يكون ذلك حافزا لتجديد أنسجة بربل بواسطة البتر. به حدود الفك ومعلما التشريحية ، يمكن وضع الطائرة بتر بدقة ، وتسهيل إعادة نمو قياس باربيل. لعامل الخبرة ، كل جراحة يستغرق سوى بضع ثوان. الانتعاش السريع ، وليس لدينا حتى الآن الكشف عن أي آثار قصيرة أو طويلة الأجل على سلوك الأسماك. الزرد مع واحدة تسبح بربل الفك العلوي ، وتناول الطعام وتتكاثر بشكل فعال كما غير الجراحية الضوابط ، ويكون البقاء للمقارنة إلى الوقت لجمع الأنسجة ، وتصل إلى 6 أشهر بعد الجراحة. وتوقع الأثر الفسيولوجية لهذه الجراحة أن يكون الحد الأدنى ل1) تم العثور أيضا على براعم الذوق خارج الفم محمولا على بربل على أجزاء أخرى كثيرة من الأسماك ظهارة ، بما في ذلك الشفاه والخدين والرأس 5 ، و 2) براعم الذوق التفريق تظهر على بربل وتجديد في غضون 72 ساعة (وكلير وآخرون ، بيانات غير منشورة.) وهذا يجعل من نظام الفك العلوي بربل مينيملي لدراسة التئام الجروح ، وعودة التوعي ، وعودة التعصيب ضمن سياق الفقاريات الكبار.
بعد تحريض الجراحية للتجديد ، يمكن جمعها على فترات barbels لقياس morphometric و / أو التحليل المجهري للانسجة محددة. مريح ، والفك العلوي بربل تقريبا طول (2-3 ملم) وقطرها (100-200 ملم) من جنين الزرد ، وتسهيل تطبيق البروتوكولات القياسية عديدة ، بما فيها الأنسجة البارافين ، cryosectioning ، المناعية كلها جبل ، وفي الموضع التهجين. أخذت معا ، وهذه الميزات تجعل من الفك العلوي بربل خيارا ممكنا للغاية في الجسم الحي نموذج لدراسة إصلاح الأنسجة وتجديدها.
Acknowledgements
وقد وضعت هذه الأساليب التي كتبها ثعبان البحر خلال إجازة البحوث في مختبر JT وقدم الدعم من قبل مجلس جامعة ديبول البحوث والمعاهد الوطنية للصحة / NIDCR R01 منحة لJT (DE016678). نحن الامتنان لجهود هنتر كارولين والحيوان فني الرعاية الأساسية في CMRC مرفق الزرد وبولينا Pawluczuk مساعد مختبر لدينا في المرحلة الجامعية.
Materials
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
- Fish system water
- 2 zebrafish crossing tanks
- MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
- sterile 120-mm Petri plate
- wet paper towels
- blunt metal spatula
- Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
- Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
- methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
- small aquarium fishnet
Tissue collection and agar embedding
- 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
- 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
- 250 mL glass flask
- 2% agarose in distilled water
- standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
- small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
- warm water bath (50-60°C)
- laboratory tape
- black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
- 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
- 9-inch glass Pasteur pipette
- pipette bulb or pump
- laboratory tissue
- small paper labels
- (optional) printed calibration scale
- wet paper towels
- zip-closure plastic bag
- scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)
References
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
