שיטות מחקר של דג הזברה לסתי בינית
Summary
לסתי דג הזברה בינית הוא איבר חוש הכסות המכיל ectodermal, mesodermal ונגזרות הרכס העצבי. חשוב לציין, בינית מבוגר יכול להתחדש לאחר כריתה הפרוקסימלי. וידאו זה מציג לסתי פיתוח בינית ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות, ואחריו הדמיה, אוסף הטבעה במורד דגימות בינית.
Abstract
Barbels הם הנספחים העור חושית למצוא דגים, זוחלים ודו. דג הזברה, Danio rerio, מפתחת שני זוגות זוג barbels האף קצר וזוג לסתי יותר. בינית מכיל רקמות תאים של ectodermal, mesodermal ומוצא הרכס העצבי, כולל בתאי העור, בלוטות, בלוטות הטעם, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים התחושתיים. שלא כמו רקמות הבוגר ביותר, בינית לסתי ברור אופטית, ומאפשר לנו לחזות את פיתוח ותחזוקה של אלו סוגי רקמות לאורך כל מחזור החיים.
וידאו זה מציג את התפתחות מוקדמת של בינית לסתי (החל כחודש לאחר ההפריה) ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות בתוך תוספת הבוגרת (> 3 חודשים לאחר ההפריה). בקצרה, בינית לסתי השמאלי של דגים הרדים מוגבה עם מלקחיים סטריליות דיסטלי רק עד קצה הזנב של maxilla. בסדר, מספריים באביב סטרילי ממוקם נגד מלקחיים כדי לחתוך את פיר בינית ברמה זו, הקמת נקודת ציון אנטומיות למטוס קטיעה. צמיחה הרגנרציה ניתן למדוד ביחס למישור זה, בהשוואה בינית הנגדי. רקמה בינית מחדש במהירות, להגיע לצמיחה מחודשת מקסימלי בתוך 2 שבועות של פציעה.
טכניקות לניתוח בינית מחדש כוללים לנתח והטבעה תואמים barbels (להתחדש ובקרה) של בארות של תקן ה-DNA ג'ל אלקטרופורזה. דגימות Embedded מצולמים בנוחות תחת stereomicroscope עבור מורפולוגיה morphometry ברוטו, והוא יכול להיות מאוחסן במשך שבועות לפני יישומים במורד כגון היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, ו / או אימונוהיסטוכימיה הר שלם. שיטות אלה להקים בינית לסתי כרומן במערכת רקמות vivo לחקר יכולת ההתחדשות של סוגי תאים מרובים בתוך ההקשר הגנטי של דג הזברה.
Protocol
Discussion
לסתי דג הזברה בינית היא מערכת רקמות מנוצלים לחקר גדילה, תחזוקה, התחדשות של תאים מסוגים כמה דג הזברה. למרות תוספת בינית אין אנלוגי האנושי, סוגי התאים שהוא מכיל הם שמור ביותר, כך שניתן ללמוד, בלוטות בעור, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים במבנה גלילי ברור אופטית פשוטה מבחינה אנטומית. בדומה סנפיר היטב למד את הזנב, רקמה בינית יכול להיגרם להתחדש על ידי קטיעה. שימוש גבול maxilla כמו ציון דרך אנטומיים, המטוס קטיעה ניתן למקם במדויק, להקל על המדידה של בינית לצמיחה מחודשת. עבור מפעיל מנוסה, כל הניתוח לוקח רק כמה שניות. החלמה מהירה, ויש לנו זוהה עד כה ללא תופעות קצרות או ארוכות טווח על התנהגות הדגים. דג הזברה עם לשחות one בינית לסתי, לאכול להתרבות בצורה יעילה כמו ניתוחי שולטת, יש להשוות את זמן ההישרדות של אוסף רקמות, עד 6 חודשים לאחר הניתוח. ההשפעה הפיזיולוגית של ניתוח זה צפוי להיות מינימלי, כי 1) את בלוטות הטעם extraoral נישא על בינית נמצאים גם על חלקים רבים אחרים של האפיתל דגים, כולל שפתיים, לחיים וראש 5, 2) בלוטות הטעם להבדיל להופיע בינית התחדשות בתוך 72 שעות (LeClair et al., נתונים שלא פורסמו.) זה הופך את בינית לסתי מערכת פולשנית ללימוד ריפוי הפצע, revascularization ו reinnervation בהקשר של החולייתנים מבוגר.
לאחר אינדוקציה כירורגית של התחדשות, barbels ניתן לאסוף במרווחים למדידת morphometric ו / או ניתוח מיקרוסקופי של רקמת קבוע. נוח, בינית לסתי כ אורך (2-3 מ"מ) קוטר (100-200 מ"מ) של עובר דג הזברה, להקל את היישום של פרוטוקולים סטנדרטיים רבים, כולל היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, כל הר אימונוהיסטוכימיה ו באתרו הכלאה. יחדיו, תכונות אלו להפוך את בינית לסתי ריאלי מאוד במודל vivo ללימוד ולתיקון רקמות והתחדשות.
Acknowledgements
שיטות אלו פותחו על ידי צלופח במהלך חופשת מחקר במעבדה של JT תמיכה סופק על ידי אוניברסיטת DePaul המועצה למחקר NIH / NIDCR R01 להעניק JT (DE016678). אנו בתודה להכיר את המאמצים של האנטר קרוליין, טיפול בבעלי חיים טכנאי במתקן גרעין דג הזברה CMRC ופאולינה Pawluczuk, לבורנטית ראשון שלנו.
Materials
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
- Fish system water
- 2 zebrafish crossing tanks
- MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
- sterile 120-mm Petri plate
- wet paper towels
- blunt metal spatula
- Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
- Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
- methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
- small aquarium fishnet
Tissue collection and agar embedding
- 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
- 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
- 250 mL glass flask
- 2% agarose in distilled water
- standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
- small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
- warm water bath (50-60°C)
- laboratory tape
- black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
- 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
- 9-inch glass Pasteur pipette
- pipette bulb or pump
- laboratory tissue
- small paper labels
- (optional) printed calibration scale
- wet paper towels
- zip-closure plastic bag
- scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)
References
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
