Методы изучения данио рерио Верхнечелюстная Барбель
Summary
Данио верхнечелюстной усач является покровный орган чувств содержащие эктодермы, мезодермы и нервной производных гребня. Важно отметить, что взрослый усач может регенерировать после проксимальной ампутации. Это видео знакомит верхнечелюстной развития усач и демонстрирует, хирургический протокол, чтобы вызвать регенерацию, а затем сбор, вложение и вниз по течению изображений образцов усач.
Abstract
Усики являются придатками кожи сенсорных обнаружили у рыб, пресмыкающихся и земноводных. Данио рерио, данио rerio, разрабатывает две пары усиков-короткие носовые пары и больше верхнечелюстной пары. Усик ткань содержит клетки эктодермы, мезодермы и нервной происхождения гребень, в том числе клеток кожи, желез, вкусовые рецепторы, меланоциты, кровообращения сосудов и нервных окончаний. В отличие от большинства взрослых тканей, верхнечелюстной усач является оптически ясно, что позволяет нам представить себе развитие и поддержание этих типов тканей на протяжении всего жизненного цикла.
Это видео показывает раннее развитие верхнечелюстных усач (начиная примерно через месяц после оплодотворения) и демонстрирует, хирургический протокол, чтобы вызвать регенерацию в придаток взрослых (> 3 месяцев после оплодотворения). Короче говоря, левой верхнечелюстной усач из наркоза рыбу повышенным стерильным пинцетом только дистальнее хвостового края верхней челюсти. Штрафа, стерильными ножницами весной позиционируется против щипцы, чтобы сократить вал усача на этом уровне, создание анатомических ориентиром для ампутации плоскости. Регенеративной роста могут быть измерены по отношению к этой плоскости, и по сравнению с контралатеральной усач. Усик ткань восстанавливается быстро, достигая максимального отрастания течение 2 недель после травмы.
Методы анализа регенерированного усач включают рассечение и вложение соответствует пары усиков (регенерации и контроля) в лунки стандартный гель-электрофореза ДНК. Встроенные образцов удобно фотографироваться под стереомикроскопа за грубые морфологии и морфометрии, и могут храниться в течение недели до вниз по течению приложения, такие как парафин гистологии, cryosectioning, и / или целые иммуногистохимии монтирования. Эти методы создания верхнечелюстной усач, как роман, в естественных условиях система ткани для изучения регенеративной способности нескольких типов клеток в генетическом контексте рыбок данио.
Protocol
Discussion
Данио верхнечелюстной усач является недостаточно ткани систему для изучения роста, поддержание и восстановление из нескольких типов клеток в данио. Хотя придаток усач не имеет человеческого аналоговый, типы клеток, содержащиеся в нем хорошо сохранились, что дает возможность изучать кожу, железы, меланоциты, кровообращения сосудов и нервов в оптически прозрачные и анатомически простые цилиндрические структуры. Как и в хорошо изученных хвостового плавника, усач ткань может быть привлечен к регенерации путем ампутации. Использование границе верхней челюсти в качестве анатомического ориентира ампутации плоскости может быть помещен точно, что облегчает измерение усач отрастания. Для опытного оператора, каждая операция занимает всего несколько секунд. Восстановление происходит стремительными темпами, и мы до сих пор не обнаружил ни одного короткого или долгосрочного воздействия на поведение рыб. Данио рерио с одним верхнечелюстной плавать усач, едят и размножаются так же эффективно, как не-хирургического контроля, а также имеют сопоставимые выживание до момента ткани коллекции, до 6 месяцев после операции. Физиологического воздействия этой операции по прогнозам, будет минимальным, поскольку 1) внеротовых вкусовые рецепторы осуществляется на усач также можно найти на многих других частях рыбы эпителия, в том числе губ, щек и глава 5, и 2) дифференциации вкусовые рецепторы появляются на регенерирующим усач в течение 72 часов (Леклер и соавт., неопубликованные данные). Это делает верхнечелюстной усач минимально инвазивной системы для изучения заживления ран, реваскуляризации и реиннервации в контексте взрослых позвоночных.
После хирургической индукции регенерации, усики могут быть собраны в интервалы для морфометрических измерений и / или микроскопический анализ основных тканей. Удобно, верхнечелюстной усач составляет приблизительно длину (2-3 мм) и диаметра (100-200 мм) данио эмбриона, что облегчает применение многих стандартных протоколов, в том числе парафин гистологии, cryosectioning, целые монтажа иммуногистохимии, и на месте гибридизации. Взятые вместе, эти особенности делают верхнечелюстной усача очень возможно, в естественных условиях модель для изучения ремонте и регенерации тканей.
Acknowledgements
Эти методы были разработаны EEL во время исследования оставляют в лаборатории JT была оказана поддержка со стороны Университета Де Пола исследовательского совета и NIH / NIDCR R01 предоставить JT (DE016678). Мы выражаем глубокую признательность усилиям Кэролайн Хантер, специалист по уходу за животными в основной объект данио CMRC и Паулина Pawluczuk, наш студент лаборанта.
Materials
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
- Fish system water
- 2 zebrafish crossing tanks
- MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
- sterile 120-mm Petri plate
- wet paper towels
- blunt metal spatula
- Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
- Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
- methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
- small aquarium fishnet
Tissue collection and agar embedding
- 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
- 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
- 250 mL glass flask
- 2% agarose in distilled water
- standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
- small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
- warm water bath (50-60°C)
- laboratory tape
- black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
- 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
- 9-inch glass Pasteur pipette
- pipette bulb or pump
- laboratory tissue
- small paper labels
- (optional) printed calibration scale
- wet paper towels
- zip-closure plastic bag
- scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)
References
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
