De zebravis bovenkaak barbeel is een integumentary zintuig met ectodermale, mesodermale en de neurale lijst derivaten. Belangrijker nog is dat de volwassen barbeel regenereren na proximale amputatie. Deze video introduceert maxillaire barbeel ontwikkeling en demonstreert een chirurgische protocol voor regeneratie te induceren, gevolgd door de collectie, inbedding en stroomafwaarts beeldvorming van barbeel exemplaren.
Barbelen zijn huid zintuiglijke aanhangsels gevonden in vissen, reptielen en amfibieën. De zebravis, Danio rerio, ontwikkelt twee paar barbels-een korte neus en een paar langere maxillaris paar. Barbeel weefsel bevat cellen van ectodermale, mesodermale en de neurale lijst oorsprong, waaronder de huid cellen, klieren, smaakpapillen, melanocyten, de bloedsomloop schepen en sensorische zenuwen. Tegenstelling tot de meeste volwassen weefsel, de bovenkaak barbeel is optisch helder, waardoor we aan de ontwikkeling en het onderhoud van deze types weefsel te visualiseren gedurende de hele levenscyclus.
Deze video toont vroege ontwikkeling van de bovenkaak barbeel (vanaf ongeveer een maand na de bevruchting) en toont een chirurgische protocol om regeneratie te induceren in de volwassen aanhangsel (> 3 maanden na de bevruchting). In het kort, is de linker maxillaire barbeel van een verdoofde vis verhoogd met steriele pincet net distaal van de caudale rand van de bovenkaak. Een fijne, steriele schaar de lente is gepositioneerd ten opzichte van de tang om de barbeel as cut op dit niveau, tot oprichting van een anatomische mijlpaal voor de amputatie vliegtuig. Regeneratieve groei kan worden gemeten ten opzichte van dit vlak, en in vergelijking met de contralaterale barbeel. Barbeel weefsel regenereert sneller, het bereiken van maximale hergroei binnen 2 weken na letsel.
Technieken voor het analyseren van de geregenereerde barbeel ook ontleden en inbedding matched pairs van barbels (regenereren en controle) in de putjes van een standaard DNA elektroforese gel. Ingebedde monsters zijn gunstig gefotografeerd onder een stereomicroscoop voor bruto morfologie en morfometrie, en kan worden opgeslagen voor weken voorafgaand aan de downstream-toepassingen zoals paraffine histologie, cryosectioning, en / of hele berg immunohistochemie. Deze methoden stellen de maxillaire barbeel als een roman in vivo tissue systeem voor het bestuderen van de regeneratieve capaciteit van meerdere celtypen in de genetische context van de zebravis.
De zebravis bovenkaak barbeel is een onderbenut weefsel systeem voor het bestuderen van de groei, het onderhoud en regeneratie van verschillende celtypes in de zebravis. Hoewel de barbeel aanhangsel heeft geen menselijke analoge, worden de celtypen die het bevat zeer goed geconserveerd, waardoor het mogelijk is voor de huid, klieren, melanocyten, de bloedsomloop vaten en zenuwen in een optisch heldere en anatomisch eenvoudige cilindrische structuur te bestuderen. Net als bij de goed bestudeerde staartvin, kan barbeel weefsel geïnduceerd worden om zich te vernieuwen door amputatie. Met behulp van de rand van de bovenkaak als een anatomisch oriëntatiepunt, kan de amputatie vliegtuig precies geplaatst worden, het vergemakkelijken van de meting van de barbeel hergroei. Voor een ervaren operator, elke ingreep duurt slechts enkele seconden. Het herstel is snel, en we hebben tot nu toe ontdekt geen korte of lange termijn effecten op vissen gedrag. Zebravissen met een maxillaire barbeel zwemmen, eten en ras zo goed als niet-chirurgische controles, en hebben vergelijkbare overleven tot de tijd van weefsel verzamelen, tot 6 maanden na de operatie. De fysiologische effecten van deze operatie zal naar verwachting minimaal omdat 1) de extraorale smaakpapillen aan boord van de barbeel zijn ook te vinden op vele andere delen van de vis epitheel, met inbegrip van de lippen, wangen en hoofd 5, en 2) differentiëren smaakpapillen op de regenererende barbeel binnen 72 uur (LeClair et al.., niet-gepubliceerde gegevens.) Hierdoor is de maxillaire barbeel een minimaal invasieve systeem voor het bestuderen van wondgenezing, revascularisatie, en reïnnervatie in het kader van een volwassen gewervelde dieren.
Na chirurgische inductie van regeneratie, kan barbels worden verzameld met intervallen voor morfometrische meting en / of microscopische analyse van vaste weefsel. Handig is dat de kaak barbeel is ongeveer de lengte (2-3 mm) en diameter (100-200 mm) van een zebravis embryo, het vergemakkelijken van de toepassing van de vele standaard protocollen, zoals paraffine histologie, cryosectioning, hele-mount immunohistochemie, en in situ hybridisatie. Tezamen bieden deze kenmerken maken de maxillaire barbeel een zeer haalbaar in vivo model voor het bestuderen van weefselherstel en regeneratie.
Deze methoden zijn ontwikkeld door EEL tijdens een onderzoek achter in het lab van JT ondersteuning werd verleend door de DePaul University Research Council en een NIH / NIDCR R01 toe te kennen aan JT (DE016678). Wij dankbaar erkennen de inspanningen van Caroline Hunter, dierverzorging technicus in de CMRC zebravis kernfaciliteit en Paulina Pawluczuk, onze undergraduate laborant.
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
Tissue collection and agar embedding