Il pesce zebra mascellare barbi è un organo di senso tegumentario contenente ectodermica, mesodermica e derivati della cresta neurale. È importante sottolineare che il barbo adulti in grado di rigenerare dopo l'amputazione prossimale. Questo video presenta mascellare sviluppo barbi e dimostra un protocollo chirurgico per indurre la rigenerazione, seguita dalla raccolta di immagini, l'incorporamento ea valle dei campioni barbo.
Barbi sono annessi cutanei sensoriali si trovano in pesci, rettili e anfibi. Il pesce zebra, Danio rerio, sviluppa due paia di barbigli: un paio nasale corta e un paio più mascellare. Barbel tessuto contiene cellule di origine ectodermica, e l'origine mesodermica cresta neurale, incluse le cellule della pelle, ghiandole, papille gustative, melanociti, vasi circolatori e nervi sensoriali. Diversamente dalla maggior parte dei tessuti adulti, il mascellare barbi è otticamente chiaro, che ci permette di visualizzare lo sviluppo e la manutenzione di questi tipi di tessuto per tutto il ciclo di vita.
Questo video mostra lo sviluppo iniziale del mascellare barbi (inizio circa un mese dopo la fecondazione) e dimostra un protocollo chirurgico per indurre la rigenerazione in appendice adulti (> 3 mesi dopo la fecondazione). In breve, il barbo mascellare sinistro di un pesce anestetizzato è elevata con una pinza sterile, appena distalmente al bordo caudale della mascella. Un bene, forbici sterili primavera è posizionato contro la pinza per tagliare l'albero barbi a questo livello, che istituisce un punto di riferimento anatomico per il piano di amputazione. Crescita rigenerativa può essere misurata rispetto a questo piano, e rispetto al controlaterale barbo. Tessuto Barbel rigenera rapidamente, raggiungendo la ricrescita massimo entro 2 settimane dalla lesione.
Tecniche di analisi del rigenerato barbi includono la dissezione e l'incorporamento di coppie di barbigli (rigenerare e controllo) nei pozzetti di un gel elettroforesi standard di DNA. I campioni sono opportunamente integrati fotografato allo stereomicroscopio per la morfologia e la morfometria lordo, e può essere conservato per settimane prima di applicazioni a valle come istologia paraffina, criosezionamento, e / o immunoistochimica montare tutto. Questi metodi stabilire il barbi mascellare come un romanzo nel sistema del tessuto in vivo per lo studio della capacità rigenerativa di più tipi di cellule nel contesto genetico di zebrafish.
Il pesce zebra mascellare barbi è un sistema di tessuto sottoutilizzate per lo studio della crescita, la manutenzione e la rigenerazione di diversi tipi di cellule in zebrafish. Anche se l'appendice barbi non ha l'analogo umano, i tipi di cellule in esso contenute sono altamente conservati, rendendo possibile lo studio della pelle, ghiandole, melanociti, vasi circolatori e nervi in una struttura otticamente chiara e anatomicamente semplice forma cilindrica. Simile al ben studiato pinna caudale, il tessuto barbi possono essere indotte a rigenerare da amputazione. Utilizzando il bordo della mascella come un punto di riferimento anatomico, il piano di amputazione può essere collocato con precisione, agevolare la misurazione dei barbi ricrescita. Per un operatore esperto, ogni intervento chirurgico richiede solo pochi secondi. Il recupero è rapido, e finora abbiamo rilevato alcun effetto a breve oa lungo termine sul comportamento dei pesci. Zebrafish con una nuotata mascellare barbi, mangiano e si riproducono nel modo più efficace non chirurgica controlli, e hanno la sopravvivenza paragonabile al momento della raccolta dei tessuti, fino a 6 mesi dopo l'intervento chirurgico. L'impatto fisiologico di questo intervento chirurgico previsto per essere minimo, perché 1) le papille gustative extraorali trasportati sulla barbi si trovano anche in molte altre parti del dell'epitelio pesci, tra cui le labbra, le guance e la testa 5, e 2) papille gustative di differenziazione appaiono il barbo rigenerante entro 72 ore (LeClair et al., dati non pubblicati). Questo rende il mascellare barbi un sistema mini-invasivo per studiare la guarigione delle ferite, rivascolarizzazione, e reinnervazione nel contesto di un vertebrato adulto.
Dopo l'induzione chirurgica della rigenerazione, barbi possono essere raccolti ad intervalli per la misurazione morfometrica e / o l'analisi microscopica dei tessuti fissi. Per comodità, il mascellare barbi è circa la lunghezza (2-3 mm) e diametro (100-200 mm) di un embrione di pesce zebra, facilitando l'applicazione di molti protocolli standard, tra cui l'istologia paraffina, criosezionamento, con tutto il montaggio immunoistochimica, ed in situ ibridazione. Prese insieme, queste caratteristiche rendono il mascellare barbi altamente fattibile modello in vivo per studiare la riparazione dei tessuti e la rigenerazione.
Questi metodi sono stati sviluppati da EEL durante un congedo di ricerca nel laboratorio di JT è stato fornito supporto da parte dell'Università DePaul Research Council e una NIH / NIDCR R01 concedere a JT (DE016678). Noi riconosciamo con gratitudine gli sforzi di Hunter Caroline, la cura degli animali tecnico nella struttura centrale zebrafish CMRC e Paulina Pawluczuk, il nostro assistente di laboratorio di laurea.
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
Tissue collection and agar embedding