Der Zebrafisch Oberkiefer Barbe ist ein integumentary Sinnesorgan mit ektodermalen, mesodermalen und Neuralleiste Derivate. Wichtig ist, dass die erwachsenen Barben nach proximal Amputation zu regenerieren. Dieses Video stellt Oberkiefer Barben Entwicklung und zeigt eine chirurgische Protokoll, um die Regeneration zu induzieren, durch Sammlung, Einbett-und nachgelagerten Bildgebung von Barben Exemplare folgten.
Barben sind hautsensorischen Anhängsel bei Fischen, Reptilien und Amphibien gefunden. Der Zebrafisch, Danio rerio, entwickelt zwei Paar Barteln-eine kurze Nase Paar und einen längeren Oberkiefer Paar. Barbel Gewebe enthält Zellen ektodermalen, mesodermalen und Neuralleiste Ursprungs, einschließlich Hautzellen, Drüsen, Gaumen, Melanozyten, Kreislauf-Gefäße und sensorischen Nerven. Anders als die meisten adulten Gewebe ist die Ober-Barbe optisch klar, so dass wir die Entwicklung und Wartung dieser Gewebearten während des gesamten Lebenszyklus zu visualisieren.
Dieses Video zeigt frühe Entwicklung des Oberkiefers Barbe (Beginn etwa einen Monat nach der Befruchtung) und zeigt eine chirurgische Protokoll, um die Regeneration im adulten Anhängsel (> 3 Monate nach der Befruchtung) zu induzieren. Kurz gesagt, ist die linke Oberkiefer Barben eines betäubten Fische mit einer sterilen Pinzette gerade distal bis zum kaudalen Rand des Oberkiefers erhöht. Eine feine, sterile Schere Frühjahr gegen die Zange positioniert, um die Barbe Welle auf dieser Ebene geschnitten, Gründung einer anatomischen Landmarke für die Amputation Ebene. Regenerative Wachstum kann in Bezug auf diese Ebene gemessen werden, und im Vergleich zu der kontralateralen Barben. Barbel Gewebe regeneriert sich schnell und erreichte maximal Nachwachsen innerhalb von 2 Wochen nach der Verletzung.
Techniken für die Analyse der regeneriert Barben gehören sezieren und Einbettung paarweise Barben (regenerieren und Kontrolle) in die Vertiefungen einer Standard-DNA-Elektrophorese-Gel. Embedded Proben sind bequem unter einem Stereomikroskop für grobe Morphologie und Morphometrie fotografiert, und kann für mehrere Wochen aufbewahrt vor Downstream-Anwendungen wie Paraffin Histologie werden, Kryoschneiden und / oder ganze Berg Immunhistochemie. Diese Methoden zu etablieren Oberkiefer Barbe als neuartige In-vivo-Gewebe-System für die Erforschung der Regenerationsfähigkeit der verschiedenen Zelltypen innerhalb des genetischen Zusammenhang mit der Zebrafisch.
Der Zebrafisch Oberkiefer Barbe ist eine nicht ausgelastete Gewebe für die Untersuchung des Wachstums, Wartung und Erneuerung von mehreren Zelltypen im Zebrafisch. Obwohl die Barbe Anhängsel hat kein Mensch analog, sind die Zelltypen enthält hoch konserviert, die es ermöglichen, Haut, Drüsen, Melanozyten, Kreislauf-Gefäße und Nerven in eine optisch klare und anatomisch einfachen zylindrischen Struktur zu studieren. Ähnlich wie bei den gut untersuchten Schwanzflosse kann Barben Gewebe induziert durch Amputation zu regenerieren. Mit der Grenze des Ober-als anatomische Landmarke, kann die Amputation Flugzeug genau platziert werden, die Messung der Barbe Nachwachsen. Für einen erfahrenen Operateur nimmt jeder Operation nur ein paar Sekunden. Recovery ist schnell, und wir haben bisher keine kurz-oder langfristige Auswirkungen auf Fische Verhalten erkannt. Zebrafisch mit einem Ober-Barben schwimmen, essen und Rasse so effektiv wie nicht-chirurgischen Kontrollen und haben vergleichbare Überlebensrate bis zum Zeitpunkt der Gewebe Sammlung, bis zu 6 Monate nach der Operation. Die physiologische Wirkung dieser Operation voraussichtlich minimal sein, weil 1) die extraorale Geschmacksknospen auf der Barbe durchgeführt auch auf vielen anderen Teilen der Fisch Epithel, einschließlich der Lippen, Wangen und Kopf 5 gefunden werden, und 2) unterscheiden Gaumen erscheinen auf die regenerierende Barben innerhalb von 72 Stunden (LeClair et al., unveröffentlichte Daten). Das macht die Ober-Barbe ein minimal-invasives System zur Untersuchung der Wundheilung, Revaskularisation und Reinnervation im Rahmen eines erwachsenen Wirbeltieren.
Nach der chirurgischen Induktion von Regeneration, kann Barben in Abständen für morphometrische Messung und / oder mikroskopische Analyse von fixiertem Gewebe gesammelt werden. Praktischerweise ist der Oberkiefer Barben etwa die Länge (2-3 mm) und Durchmesser (100-200 mm) eines Zebrafisch-Embryos, die Erleichterung der Anwendung von vielen Standard-Protokollen, einschließlich Paraffin Histologie, Kryoschneiden, ganze-mount Immunhistochemie und in situ Hybridisierung. Zusammen genommen machen diese Features die oberen Barben ein sehr machbar in vivo Modell für die Untersuchung die Reparatur von Gewebe und Regeneration.
Diese Methoden wurden von EEL während eines Forschungsaufenthaltes verlassen im Labor von JT-Unterstützung durch die DePaul University Research Council und ein NIH / NIDCR R01 Zuschuss an JT (DE016678) zur Verfügung gestellt wurde entwickelt. Wir danken für die Bemühungen von Caroline Hunter, Tierpflege-Techniker in der CMRC Zebrafisch Core Facility und Paulina Pawluczuk, unsere Studenten Laborantin.
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
Tissue collection and agar embedding