Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler
Summary
Nöral devreleri kontrol ve analiz<em> In vivo</em> 3 boyutlu kümeler beyin bölgelerinde istenilen virüs ve diğer reaktifler teslim bir teknoloji ile daha da kolaylaşabilir. Biz karmaşık beyin devrelerinin optik manipülasyonu sağlayan akışkan enjektör dizi özelleştirilmiş imalat, ve viral kodlanmış optik duyarlaştırıcılar teslim göstermektedir.
Abstract
Nöral devreleri anlayışımız hızla karmaşık 3 genleri hedefleyen bir teknoloji ile büyük ölçüde kolaylaştırılmış olacaktır yaramak his, düşünce, duygu ve eylem, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar nasıl bozuk hesaplamaları nasıl arabuluculuk hızlı oluşturulmasını sağlayarak boyutlu sinir devreleri, "devre düzeyinde transgenik." Biz son zamanlarda ışığa duyarlı proteinler için kodlama virüsler spesifik hücre tiplerinin milisaniyelik zaman çizelgesi aktivasyon duyarlı ve bozulmamış beyin susturma hangi yöntemler geliştirdik. Biz burada, beynin 3 boyutlu bir yapı içinde tanımlanan noktaları onlarca virüslerin (ya da diğer sıvılar) sunma yeteneğine sahip bir enjektör dizi tasarım ve uygulama mevcut (<strong> Şekil. 1A, 1B</strong>). Enjektör dizi, her biri poliimid / erimiş silika besleyen her sürücü, bir şırınga, yüksek basınca dayanıklı konnektörü üzerinden kapiller bir veya daha fazla deplasmanlı pompalar oluşmaktadır. Kılcal damarların boyutlu ve daha sonra stereotaktik bir konumlandırma kurulu özel öğütülmesi ile belirtilen istenilen yerlerde takılı, böylece virüs veya diğer reaktifler beyin bölgelerinde istenilen şekilde ayarlanabilir teslim edilmek üzere izin. Cihazı kullanmak için, cerrah ilk yağı ile akışkan alt sistemi tamamen doldurur virüs kılcal damarların Dolgularda, cihaz beynin içine ekler, ve yavaş yavaş (<0.1 mikrolitre / dk) reaktifler aşılamaktadır. Enjektör dizi paralel doğa ışık tanımlanmış beyin devrelerinin aktivasyonunu ve susturulması etkinleştirmek için, optik duyarlaştırıcılar gibi viral payload ile tüm sinir devrelerinin, hızlı, doğru, ve sağlam etiketleme kolaylaştırır. Gibi beyin bölgelerinde istenilen setleri ışık teslimat için fiber optik dizileri gibi diğer teknolojiler ile birlikte, nedensel sinir fonksiyonları bozulmamış beyin sistematik problama sağlayan bir araç kutusu oluşturmak için umut. Bu teknoloji sadece memelilerde devre odaklı sinirbilim gibi sistematik yaklaşımlar açmak ve insan olmayan primatların gibi büyük hayvanlarda beyin bölgelerinin etiketleme kolaylaştırmak, ama aynı zamanda hücre özel optik kontrol protez için bir klinik translasyonel yolu açabilir olmayabilir olan hassas dirençli beyin bozuklukları gelişmiş tedavi sağlar. Son olarak, burada açıklandığı gibi bu tür cihazların kolaylaştırabilir tam-zamanlı kolay bir kullanıcı tarafından özelleştirilebilir moda 3 boyutlu yapılar için bu tür kök hücreler ve farmakolojik ajanlar gibi diğer taşıma kapasitesi, akışkan teslimat,.
Protocol
Discussion
(Örneğin, 1,4,5,6,7,8 kısa ışık darbeleri yanıt olarak, geçici olarak hassas bir moda, son yıllarda, genetik olarak kodlanmış optik duyarlaştırıcılar bir dizi aktif hale nöronlar etkinleştirilmiş olması ve in vivo susturuldu , 11). Nöronlar memeli beyninde ışık hassaslaşmış olan bir önemli yöntem, fareler ile maymunlar arasında değişen hayvanların beyin opsins kodlayan genlerin sunabilirsiniz lentiviruses ve adeno-ilişkili virüs (AAV) gibi virüsler aracılığıyla güvenli ve kalıcı bir şekilde (örneğin, 2,9,10) . Virüsler, transgenik daha hızlı gerçekleştirme süresi, özellikle bu tür fareler ve maymunlar gibi genetik model organizma değildir organizmalar için izin ve opsins için transgenik senaryolarda mümkün olmayabilir yüksek ekspresyon düzeyleri etkinleştirebilirsiniz. Burada tek bir cerrahi adımda bütün 3 boyutlu beyin yapıları viral bir gen hedef sağlayan hızlı bir zaman çizelgesi oluşturma yeteneğine sahip paralel bir enjektör dizi, "devre düzeyinde transgenik", göstermektedir. Enjektör dizi, her biri poliimid / erimiş silika besleyen her sürücü, bir şırınga, yüksek basınca dayanıklı konnektörü üzerinden kapiller bir veya daha fazla deplasmanlı pompalar oluşmaktadır. Kılcal damarların boyutlu ve daha sonra stereotaktik bir konumlandırma kurulu özel öğütülmesi ile belirtilen istenilen yerlerde takılı, böylece virüs veya diğer reaktifler beyin bölgelerinde istenilen şekilde ayarlanabilir teslim edilmek üzere izin. Cihazı kullanmak için, cerrah ilk yağı ile akışkan alt sistemi tamamen doldurur virüs kılcal damarların Dolgularda, cihaz beynin içine ekler, ve yavaş yavaş (<0.1 mcL / dk) reaktifler aşılamaktadır.
Bu teknoloji gibi yeni tür deneyler, karmaşık şekilli yapılar milisaniye davranış sırasında hassas zaman-zaman ölçeğinde kapatma (hipokampus gibi), yedeklemeli hareket edebilir ikili yapıların zamansal hassas inaktivasyon gibi geniş bir yelpazede (sağlayacaktır sol ve sağ amigdala) ve faz iki bağlı bölgelerde sürüş birden fazla ayrık beyin bölgelerinde (örneğin, pertürbasyon çapraz bölge senkronize her bölgede faaliyet bağlıdır nasıl çalışması, ya da bir alt kümesi susturmak ise bir bölgeye girdi uyarıcı ) çeşitli hedefleri olan bu girdilerin etkileri arabuluculuk için kritik anlamak için hedefler. Primat gibi büyük beyinler için, içinde yaşadığımız son zamanlarda optik hücre tipi özel nöral aktivasyon 3, büyük, karmaşık yapılar viral etiketlenmesi, davranışsal ilgili bir alanda faaliyet rahatsızlık vermesini isteyebilir göstermiştir. – Ilaçlar, nöromodülatör, nörotransmitterler, ya da hücreler, beynin karmaşık 3-D desenler, geçici olarak kesin bir şekilde paralel enjektör dizileri hemen hemen herhangi bir yük enjekte etmekte kullanılan olabileceğini unutmayın. Son olarak, translasyonel bir bakış açısıyla, hızlı, hasta özelleştirilmiş gen tedavisi ya da ilaç dağıtım cihazları hızla olabilir, potansiyel olarak kullanılması yoluyla, çeşitli patolojiler için yeni tedaviler destekleyen, bireysel beyin geometrileri maç için özel olarak tasarlanmış ve imal edilmiş optik kontrol moleküllerdir.
Enjektör diziler hem de mekansal ve hacimsel olarak, kesin olmak için tasarlanmıştır. X ve Y yönünde, bu delikli enjektörler, enjektörler birbirine paralel tutulur, böylece sığacak kadar sadece büyük bir ucuz mini-mill kullanarak çok doğru yerleştirilmiş delik delme gerçekleştirilir, ve kesin bir konumu. Z-yönünde stereotaksik cerrahi kendisi ile eşdeğer bir hassasiyet seviyesini sağlayan, enjektörler, stereotaksik cihazları kullanırken kesilmiş bulunmaktadır. Hamilton pompasının yanı sıra, hassasiyet, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) alanına adapte sıfıra yakın ölü hacim konektörler, hacimsel hassasiyet ortaya çıkar. Enjektörler, güçlü ve kesin şeklini ve basınç altında boşluk korur yeterince sert erimiş silika kapiler boru, çelik kanüller gibi alternatifler büyük duvar kalınlığı olmadan yapılır. Paralel enjektör dizi deney çeşitli adapte küçük değişiklikler kolayca yapılabilir. Örneğin, küçük hacimli bir virüs ya da ince aralığı gerekiyorsa, daha küçük kılcal boru ilgili küçük bir matkap ucu ile birlikte, istihdam edilebilir. Gelecek cihazların boyutunu en aza indirmek için (belki serbestçe hareket eden hayvanların başlarına bu tür cihazların monte edilmesini sağlayan), paralel enjektörlerin sayısını artırmak için, mikroakışkan kanalları ve pompaları kullanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ESB NIH Yönetmen Kullanıcı Yeni Yenilikçisi Ödülü (OD002002-01 DP2), NIH Mücadelesi Grant 1RC1MH088182-01, NIH Büyük Fırsatlar Hibe 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0.835.878 ve 0.848.804), McGovern Enstitüsü Nöroteknoloji Ödülü Programı tarafından fon kabul eder Savunma, NARSAD, Alfred P. Sloan Vakfı, Jerry ve Marge Burnett, Nörobilim, MIT Media Lab, Benesse Vakfı ve Wallace H. Coulter Vakfı Yenilik SFN Araştırma Ödülü Bölümü.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
| Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
| Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
| Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
| 10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Company | 701N | Need one per injection site |
| Mouse stereotax | Tool | Stoelting | 51725D | |
| Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
| 0.011″ diameter drill bit for mini mill | Tool | Mcmaster-Carr | 8915A12 | |
| 1/32″ diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
| High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
| Dental drill accessories | Tool | Pearson | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 |
|
| 1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small-Parts | HTX-15R | |
| 1-72 binding slotted machine screw | Material | Small-Parts | MX-0172B | |
| 1-72 hex nut | Material | Small-Parts | HNX-0172 | |
| PCB proto-board, 1/32″ thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
| Acrylic Sheet, 1/8″ thick | Material | Mcmaster-Carr | 8560K239 | |
| HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
| Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
| 5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
| Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR | 63018-827 |
References
- Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).
- Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. Neuron. 50, 23-33 (2006).
- Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain. Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).
- Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).
- Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
