Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

1. בניית קלאמפ Stereotaxic מהדק stereotaxic משמש לחיבור מערך מזרק אל stereotax, כך הם מרססים במקביל הזרוע stereotaxic. כל מעבדה זקוקה רק אחד מהדק, אלא אם כן הוא צפוי כי יותר מפעם אחת הניתוח יכול להתבצע בו זמנית. במקרה זה, לעשות את אותו מספר כמו המספר המקסימלי הצפוי של ניתוחים בו זמנית. זה יכול להיות גם רצוי לבצע נוסף, במקרה של נזק הראשונה. כדי להפוך את מהדק stereotaxic, ראשית, בקוטר חיצוני 1.5 מ"מ (OD) פלדה צינורית היא לחתוך 2 ס"מ באורך, אחד מסתיים הוא Dremeled מטה עד שטוח. בשלב הבא, חתיכה קטנה (כ 0.5 x 0.5 ס"מ) הוא לגזור של PCB אב – לוח, כדי לשמש כשומר רווח. בעזרת חותך לייזר על מנת להבטיח כי כל הקיצוצים שנעשו הן בניצב לפני השטח של החומר, שני מלבנים זהים (1 / 2 "x 3 / 8") נחתכים מתוך יריעות "1 / 8 אקריליק, כל מלבן שיש שני חורים עגול פינות השני של המלבן. החור הראשון בקוטר 1.5 מ"מ, והוא פשוט גדול מספיק כדי להכיל את הצינורית מתכת חזק. החור השני יש בקוטר 1 / 16 "(תרשים 1C). צינורית המתכת מוכנס לתוך חור 1.5 מ"מ של מלבן אחד, ואז דרך חור 1.5 מ"מ של השני. הקצה התחתון של הצינורית הוא מתואם עם הפאה התחתונה של המלבן התחתון, יוצרים צורה של מקל הוקי. תוך שמירה על spacer בחוזקה בין שני מלבנים, מבנה זה הוא דבוקים זה לזה באמצעות דבק חם סביב החורים צינורית ו 1.5mm, להיות זהיר, כדי למנוע הדבקה spacer על מלבנים. פלסטלינה עשוי להיות מועיל להחזיק דברים יחד בתהליך זה. לאחר הדבק התייבש, בורג 1-72 מוכנס לתוך החור 1 / 16 מן הצד העליון של המלבנים. ואז אגוז 1-72 hex מוברג על סוף בורג 1-72, והידק. בורג אגוז לשרת להחזיק את מהדק יחד. כדי לצרף את אגוז hex להתמודד התחתונה של המלבן התחתון, כמויות קטנות של אפוקסי 5 דקות הם ירדו מסביב לקצה של אגוז hex, מבלי לאפשר אפוקסי להיכנס הנושאים של אגוז את הבורג או hex. חימר כל דוגמנות מוסר, והוא אישר כי spacer יכול להיות מוחזק במקומו על ידי הידוק בורג. 2. הכנת המערכת עבור מערך מזרק אישית: המילטון המשאבה stereotax מערכת ההזרקה מערך יכול להיות מותאם אישית כדי להגדיר כמעט כל הקואורדינטות במוח. מאתרת המשתמש הראשון הקואורדינטות של אתרי הזרקה הרצוי בעכבר (או מינים אחרים) אטלס המוח, המרת הקואורדינטות המתאימות בשימוש על ידי stereotax (כאן, ה-X,-Y, ו-Z קואורדינטות). מספר אתרי הזרקה (שלוש דמויות 1A ו-1B) יהיה להלן ייקרא k. מספר k של 10 מזרקים μl המילטון ממוקמים משאבת הזרקה / נסיגה מזרק כגון זו של מנגנון הרווארד. בשלב הבא, 3 באורך חתיכות של צינורות פוליאתילן מחוברים באופן מאובטח מחט של מזרק אחד המילטון. עבור כל קטע של צנרת פוליאתילן, ה-F-252 שרוול צינורות מאפצ'רץ' המדעית היא החליקה על סוף פתוח מצורף מתאם P-627 צינורות באמצעות אגוז כלול טבעת חזוק, גם מאפצ'רץ' מדעי. 3. בניית מערך מותאם אישית Injector כל מערך ההזרקה מותאם אישית כדי להגדיר את הקואורדינטות שהמשתמש בוחר. עם זאת, עבור זוגות של קואורדינטות שונים רק על ידי ותרגום / או רוטציה, מערך באותו מזרק ניתן להשתמש. בהתחשב רק קואורדינטות X ו – Y יחסית של אתרי הזרקה, חורים k הם קדחו לתוך לוח פרוטו-PCB בעובי של 1 / 32 ", עם מרווח יחסית זהה. אלה הם קדחו חורים באמצעות טחנת מיני Modela ו .011" קוטר לקדוח קצת מן מקמאסטר-קאר. הקפד להשתמש בקצב איטי של הקידוח (Z-מהירות) כדי למנוע שבירה או לובש את המקדח. לפני הסרת הלוח מן הטחנה, מלבן הוא קדח חורים קטנים מסביב, באמצעות המקדח גדול בקוטר של 1 / 32 ", כדי להימנע לובש את אחד קטן קוד עבור טחנת מיני יכול להיווצר בקלות באמצעות MATLAB:. מדגם קוד הניתן את הקבצים הבאים. generate.m – MATLAB הקוד ליצירת קוד Modela מן הקואורדינטות הרצויה holes_ex.rml – קוד Modela עבור דפוס טבעת קידוח (שמונה חורים) חזרה ללוח ל-הפרוטו outline_ex.rml – קוד Modela עבור מלבן סביב קידוח חורים 245 מיקרומטר OD/100 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) צינורות סיליקה התמזגו נימי, זמינים Polymicro טכנולוגיות, הוא חתך לתוך מספר k של 3 אינטש חתיכות. אלה מהווים את מרססים בודדים. חתיכת הפנויה של צינור נימי הוא פישפשכל החורים, כדי לסלק פסולת ללא סתימת מרססים בפועל. מרססים מוכנסים אז באמצע הדרך לתוך כל חור, כך שהם מוחזקים בחוזקה במקביל אחד לשני. מרססים הם epoxied לעלות, יוצרים את המבנה של מערך מזרק. כל שנותר הוא לקצץ את מרססים לאורך הנכון. מערך מזרק מצורף מהדק stereotaxic ידי הצבת פינה אחת של לוח פרוטו בין המלבנים אקריליק, ולאחר מכן על ידי הידוק בורג של מהדק stereotaxic. לאחר מכן, צינורית המתכת של מהדק מצורפת stereotax, באמצעות מנגנון ההתקשרות של stereotax. כל אחד מאלה נעשית תחת מיקרוסקופ. עבור אחד מרססים החיצונית (כלומר, כזה ניתן לגשת מהצד עם קצה ישר, בלי להיתקל באף אחד מרססים אחרים), המשתרעת מעבר לקצה התחתון של לוח פרוטו הוא לגזור במספריים. עבור זריקות קליפת המוח, ראוי להיות מזרק המשתרע כ 5mm מעבר לפני השטח של לוח פרוטו. עבור זריקות עמוק יותר, מספר זה יכול להיות מוגברת על ידי גידול המקביל לעומק. קצה הוא שטוח עם כלי Dremel. טיפים Injector יכול להיות גם באדמה בזווית כאמצעי זהירות נוסף נגד סתימת, אם דיוק בעומק פחות חשוב. בשלב הבא, נקודת התייחסות יציבה נבחר בטווח של הזרוע stereotaxic, ואת מערך מזרק מועבר כך קצה שטוח של ההזרקה החיצונית, בנקודה זו התייחסות. מזרק השני הוא נבחר, יחד עם הקואורדינטות המתאימה. נחשב ההבדל יחסית גובה (Z-הכיוון) בין קואורדינטות הראשון והשני מזרק. מערך מזרק הוא נע לאורך ציר Z ידי מרחק זה יחסי. ההזרקה השנייה גזוז Dremeled באורך הנכון, כך הטיפ של ההזרקה השנייה היא עכשיו שטוחים בגובה של נקודת התייחסות. מערך מזרק ניתן להעביר את X ו Y כיוונים כדי להקל על ההשוואה בין קצה מזרק עם נקודת התייחסות. תהליך זה של זמירה חוזרים עבור מרססים הנותרים. 4. הרכבת המערכת כולה מהדק stereotaxic אישית מערך ההזרקה, הן נבנו כבר, נדרשים עבור חלק זה. בקצה האחורי של כל מזרק (סוף כי לא היה גזוז) מוכנס לתוך כחול F-240 שרוול צינורות, באמצעות אגוז P-235 ו-P-200 טבעת חזוק מאפצ'רץ' מדעי, מצורף מתאם מושחל כבר מחובר כדי לשאוב את המילטון על ידי צינורות פוליאתילן. הוראות היצרן ניתן להתייעץ לפרטים. באמצעות מחט 27-מד, שמן סיליקון מוזרק לתוך האחורי של מזרקים המילטון כך את המערכת כולה מלאה מן המזרק המילטון להטות את ההזרקה, ללא בועות אוויר בכלל. כמו מזרקים המילטון הם מחדש להציב משאבה המילטון, בהיקף הגדול ביותר האפשרי של שמן סיליקון נשמרת המזרקים. אם הניסוי דורש מזרקים יותר את המשאבה מיועדת (שניים במקרה הזה), מזרקים יכולה להיות מחולקת עם חתיכות קטנות של פלסטיק (לדוגמא, כמוסות מחט) כדי לשמור אותם במקביל זה לזה, על מנת להבטיח כי כל החלקים נמצאים נדחף על ידי המשאבה באותה מידה. או, רב מתלה שדרוג ערכת ניתן לרכוש מתקן הרווארד להחזיק עד 10 מזרקים בבת אחת. 5. זריקות / ניתוח תהליך של הזרקה עם מזרק מקביל דומה מאוד לזה של הזרקת עם פיפטה אחת. זה חיוני כדי להשתמש למילוי איטי / להחדיר שיעורי לאורך כל התהליך הזה, כי מהר שאיבה עשוי לשים דגש על המשותף בין צינורות גדולים וקטנים. מומלצים שיעור מרבי: 2 μl / דקה לטעינת וירוס, 0.1 μl / דקה עבור יציקת וירוס. עכבר הרדים ממוקם stereotax, ונשאר מורדם במהלך הניסוי. הכינו את העכבר לפי הצורך. לדוגמה, עם אזמל, חתך אחד הוא עשה את קו האמצע של העור, החל בין העיניים אל בין האוזניים. העור הוא נסוג לאחור כדי לחשוף את הגולגולת, ואת fascia הוא ניקה. פיפטה כוס משך מצורפת stereotax. עמדות הברים האוזן מותאמים עד גבחת ו למבדה מיושרים באותו הגובה, כך שקו הקושרות אותם מקביל לציר ה-Y של stereotax. צירים של stereotax מכוונים בהתאם למערכת הקואורדינטות שבה הקואורדינטות הזרקת להיות מחושב. Stereotaxic הוא התביית עם קצה פיפטה זכוכית גבחת, ולאחר מכן את קצה ממוקם מעט מעל הגולגולת ב-X ו-Y קואורדינטות של אחד האתרים ההזרקה. בעזרת מקדח שיניים, הגולגולת מתחת לקצה הוא pared בזהירות עד שלא נשאר שכבה דקה מאוד של העצם. פיפטה זכוכית יכול להיות נמוך יותרעורך וגדל לבדוק את החור שנקדח הוא מרוכז במיקום הנכון. באמצעות מחט 30-מד, חתיכה זעירה של השכבה הוא הרים בעדינות את, ב-X ו-Y קואורדינטות נכונה, כך מאטר הדורה חשוף. חור זה צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים אחד מרססים (0.25mm רחב). ראה איור 1D עבור דיאגרמה. בדרך זו, קטן, חורים רחב 0.25mm עשויים בגולגולת, ב-X ו-Y קואורדינטות המתאים לאתר כל זריקה. פיפטה הזכוכית נמחקת במיכל החדים, ואת מערך אישית מזרק מצורף stereotax באמצעות מהדק stereotaxic. כדי להגדיר נכונה את הזווית של המערך מזרק, שני מרססים החיצוניים נבחרים להיות מכויל נקודת התייחסות נתונה, כדלקמן. אחרי אחד המזרקים משתווה עם נקודת התייחסות, לשקול את ה-X ו-Y יחסי המרחקים בין אתרי הזרקה יחסית זה מזרק אחד אחר. צירים של stereotax מותאמים כך כל מערך מזרק מועבר ב-X ו-Y בכיוונים אלה מרחקים יחסית. אם ההזרקה השנייה לא מיושר עכשיו עם נקודת התייחסות, צינורית המתכת הוא התיר וסובב. תהליך זה חוזר iteratively עד מערך ההזרקה היא זווית נכונה. לפני מילוי מרססים עם וירוס, מרססים מלאים שמן סיליקון עד מזרקים נמצאים בשלב 2 μl (או יותר). זה מספק אזור חיץ, כך שכל בועות אוויר או סתימת בקצה ניתן להסיר בקלות על ידי לחיצה הנפט קדימה באמצעות משאבת המילטון, מבלי למלא את המערכת כולה עם שמן סיליקון מהחלק האחורי של מזרקים, כמו לתאר בעבר. חתיכת סטרילית של Parafilm מושם על הגולגולת, ואת מרססים הם הוריד בעדינות על Parafilm. עבור קואורדינטות עם עומק שונות מאוד, חלק הסתובבו אישית (למשל, חפץ דמוי מדרגות) יכול להקל על הטעינה. החלקים הבאים להניח כי 1 μl של הנגיף היא להיות טעון בכל אתר (הכמויות הבאות צריך להיות scaled למטה אם כמויות קטנות הן הרצוי). על מנת להבטיח כי> 1 μl של הנגיף מוזרק בכל אתר, 1.5 μl של הנגיף היא pipetted על Parafilm או גרם מדרגות בקצה של כל מזרק. עם קצב המילוי של המשאבה המילטון מוגדר μl 1 / דק ', 1.2 μl של הנגיף הוא מילא את כל מזרק. טיפ של מזרק הארוך ביותר הוא התביית על גבחת, ולאחר מכן את המערך מזרק הוא עבר ה-X ו-Y קואורדינטות של זה מזרק. אם סתימת סוגיה, לומר אם מטרות עמוק רבים מעורבים: אפילו לפני הכנסת טיפים מזרק לתוך המוח, לפעמים רצוי להתחיל את יציקת המשאבה, עד וירוס ניתן לראות העולה מתוך כל הטיפים מזרק. זו מסירה את כל בועות האוויר בקצות ההזרקה, וגם מבטיחה כי יש סתימת לא. במקרה של סתימת, המשאבה המילטון מוגדר להזרים פולס קצר במהירות גבוהה יותר של μl 2 / min, בעדינות כדי לנקות את החוסם. מערך מזרק הוא הוריד ואז, דרך החורים הקטנים שנעשו עם 30-מד מחטים, אל עומק-Z הנכון. 1 μl של הנגיף מוזרק באמצעות מזרק אחד, ב 0.1 μl / min. הזריקות נותרים לבד במשך 30 דקות. לאחר ההזרקה מערך מופק לאט מהמוח, המשאבה המילטון מוגדר להחדיר באותו קצב של μl 0.1 / דקה, כדי לבדוק סתימת בכל מזרק. ואז מרססים מנקים על ידי מילוי ו יציקת 1.5 μl של אתנול ב μl 2 / min. לבסוף, מרססים הם ומילא עם שמן סיליקון כדי לשמור על אזור חיץ 2 μl בתוך מזרק אחד המילטון. כל הציוד צריך להיות מעוקר לפני ואחרי הניתוח, על פי מוסד biosafety שלך ופרוטוקולים חיה להשתמש. 6. נציג תוצאות מערך מקביל ההזרקה מאיץ את ניתוח בערך פי שווה למספר של מרססים, לא כולל התקנה זמן התאוששות, אם כי פעמים בודדות יהיה תלוי במיומנות של המטפל. עבור זריקה 1 microliter, אנחנו בדרך כלל ראה ביטוי lentivirus בתחום בקוטר של כ 1mm (איור 1E). הדיוק של הזריקה היה כזה משונות מיקום קצה, ממשפט למשפט, היה כ 45 מיקרון (סטיית התקן של המרחק מהמיקום קצה עמדת קצה המיועד). באיור 1. עיצוב, יישום, ושימוש מערך מקביל וירוס ההזרקה. סכמטית, של מערכת ההזרקה במקביל מערך, מראה תצורה משולשת מזרק, במשך שלוש זריקות סימולטני. B, תצלום של מערך משולש מזרק במקביל ניתח כמו . <strong> C, מהדק stereotaxic, המוצג המתאר מלמעלה D, איור של טכניקה יעילה, מזעור נזקים, פתיחת חורים בגולגולת עבור מזרק הכניסה לתוך המוח:. עם מקדחה של רופא שיניים, רזה הגולגולת עד עובי ~ 50 מיקרון, ולאחר מכן להשתמש קצה מחט חדה לפתוח craniotomy קטן. E, תמונה הקרינה מראה channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP שכותרתו תאים בשלושה אזורים בקליפת המוח העכבר, ממוקד כמו מזרק על ידי מערך משולש שמוצג ב