Controleren en analyseren van neurale circuits<em> In vivo</em> Zou worden vergemakkelijkt door een technologie voor de levering van virussen en andere reagentia tot de gewenste drie-dimensionale sets van hersengebieden. Tonen we aan op maat vloeibare injector reeks fabricage en levering van viraal-gecodeerde optische sensitizers, waardoor optische manipulatie van complexe hersenen circuits.
Ons begrip van neurale circuits – zou sterk worden vergemakkelijkt door een technologie voor het snel richten genen om complexe 3 – hoe ze de berekeningen die gebaat gevoel, gedachte, emotie, en actie, en hoe ze zijn beschadigd bij neurologische en psychiatrische stoornissen bemiddelen – dimensionale neurale circuits, waardoor een snelle creatie van "circuit-level transgenen." We hebben recent ontwikkelde methoden, waarin virussen die coderen voor lichtgevoelige eiwitten kunnen specifieke celtypen gevoelig te milliseconde-tijdschaal activering en silencing in de intacte hersenen. We hier presenteren het ontwerp en de implementatie van een injector reeks staat het leveren van virussen (of andere vloeistoffen) om tientallen gedefinieerde punten in de 3-dimensionale structuur van de hersenen (<strong> Afbeelding. 1A, 1B</strong>). De injector reeks omvat een of meer verdringerpompen dat elk station een set van spuiten, die elk feeds in een polyimide / fused-silica capillaire via een hoge-druk-tolerant connector. De haarvaten zijn grootte, en vervolgens ingebracht in, de gewenste locaties die door de op maat frezen een stereotactische plaatsing bord, waardoor virussen of andere reagentia te leveren om de gewenste set van hersengebieden. Voor het gebruik van het apparaat, vult de chirurg eerst de vloeibare subsysteem volledig met olie, backfills de haarvaten met het virus, voegt het apparaat in de hersenen, en blaast reagentia langzaam (<0,1 microliter / min). De parallelle karakter van de injector-array maakt een snelle, nauwkeurige en robuuste etikettering van volledige neurale circuits met virale ladingen zoals optische sensibilisatoren om licht-activatie en zwijgen van de gedefinieerde hersenen circuits. Samen met andere technologieën, zoals glasvezel-arrays voor het licht leveren om de gewenste sets van hersengebieden, hopen we een toolbox die de systematische indringende van causale neurale functies in de intacte hersenen mogelijk maakt. Deze technologie kan niet alleen open te stellen zulke systematische benaderingen van circuit gerichte neurowetenschappen bij zoogdieren, en vergemakkelijken de etikettering van de hersenen regio's in grote dieren, zoals niet-menselijke primaten, maar kan ook het openen van een klinisch pad voor translationeel cel-specifieke optische controle protheses , kan die precisie tot een betere behandeling van hardnekkige hersenaandoeningen. Tot slot kunnen dergelijke apparaten zoals hier beschreven te vergemakkelijken precies getimede vloeibare levering van andere payloads, zoals stamcellen en farmacologische stoffen, om drie-dimensionale structuren, in een gemakkelijk te gebruiker aan te passen mode.
In de afgelopen jaren hebben een aantal van genetisch gecodeerde optische sensitizers mogelijk neuronen worden geactiveerd en zwijgen in vivo in een tijdelijk-nauwkeurige wijze, in reactie op korte pulsen van licht (bijv. 1,4,5,6,7,8 , 11). Een van de belangrijkste methode waarmee neuronen zijn gevoelig voor licht in de hersenen van zoogdieren, is via virussen zoals lentivirussen en adeno-geassocieerde virussen (AAV), die kunnen leveren genen die coderen voor opsins aan hersenen van dieren, variërend van muizen tot apen, in een een veilige en duurzame wijze (bijv. 2,9,10). Virussen laten een snellere doorlooptijd doen dan genetische manipulatie, met name voor organismen die geen genetisch model organismen, zoals ratten en apen, en voor opsins in staat kan stellen hoge expressie niveaus die niet mogelijk zijn in transgene scenario's. Hier laten we zien een parallel injector reeks in staat om, in een snelle tijdschaal "circuit-level genetische manipulatie, 'waardoor gehele 3-dimensionale hersenstructuren te viraal worden gericht met een gen, in een enkele chirurgische stap. De injector reeks omvat een of meer verdringerpompen dat elk station een set van spuiten, die elk feeds in een polyimide / fused-silica capillaire via een hoge-druk-tolerant connector. De haarvaten zijn grootte, en vervolgens ingebracht in, de gewenste locaties die door de op maat frezen een stereotactische plaatsing bord, waardoor virussen of andere reagentia te leveren om de gewenste set van hersengebieden. Voor het gebruik van het apparaat, vult de chirurg eerst de vloeibare subsysteem volledig met olie, backfills de haarvaten met het virus, voegt het apparaat in de hersenen, en blaast reagentia langzaam (<0,1 pL / min).
Deze technologie zal zorgen voor een breed scala van nieuwe soorten experimenten, zoals de milliseconde-tijdschaal afsluiten van complexe,-vormige structuren (zoals de hippocampus) op precieze momenten in het gedrag, in tijd nauwkeurige inactivatie van bilaterale structuren die redundant kunnen optreden (zoals de linker en rechter amygdala) en de verstoring van meerdere discrete hersengebieden (bijvoorbeeld autorijden twee verbonden gebieden in fase om te bestuderen hoe cross-regio synchroon hangt af van activiteiten in elke regio, of het stimuleren van input voor een regio, terwijl zwijgen een subset van de doelstellingen om te begrijpen welke van de verschillende doelstellingen zijn van cruciaal belang voor het mediëren van de effecten van die ingangen). Voor grote hersenen, zoals die in de primaat, waarin we hebben onlangs aangetoond optische cel-type specifieke neurale activatie 3, storende activiteit in een gedragsmatig-relevante gebied kunnen virale etikettering van grote, complexe structuren nodig hebben. Wij merken op dat parallel injector arrays kunnen worden gebruikt voor bijna elke lading injecteren – drugs, neuromodulatoren, neurotransmitters, of zelfs cellen – in complexe 3-D patronen in de hersenen, in een tijdelijk-nauwkeurig. Tot slot, uit een translatie-standpunt, is het mogelijk dat een snelle, patiënt-customized gentherapie of drug delivery apparaten kunnen snel worden op maat ontworpen en gefabriceerd om individuele hersenen geometrieën overeenkomen, het ondersteunen van nieuwe behandelingen voor een verscheidenheid aan aandoeningen, mogelijk door het gebruik van optische controle moleculen.
De injector arrays zijn ontworpen om precies te zijn, zowel ruimtelijk als volumetrisch. In de X-en Y-richting, wordt dit bereikt door het boren van heel nauwkeurig geplaatste gaten met behulp van een goedkope mini-molen, met de gaten net groot genoeg om de injectoren, zodat de injectoren parallel worden gehouden aan elkaar passen, en in een nauwkeurige locatie. In de Z-richting, zijn de injectoren bijgesneden met behulp van een stereotaxische apparaat, waardoor een niveau van precisie gelijk aan die van de stereotaxische operatie zelf. De volumetrische precisie komt voort uit de precisie van de Hamilton pomp, evenals de bijna-zero dead volume-connectors, aangepast van de hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC) veld. De injectoren zijn gemaakt van fused silica capillaire buis, die is sterk en stijf genoeg dat het precieze vorm en de afstand onder druk houdt, zonder dat de grotere wanddikte van alternatieven, zoals staal canules. Kleine wijzigingen kunnen gemakkelijk worden gemaakt om de parallelle injector reeks aan te passen aan een verscheidenheid van experimenten. Bijvoorbeeld, als een kleiner volume van het virus of fijner afstand nodig is, kunnen kleinere capillaire buizen worden gebruikt, samen met een bijbehorende kleinere boor. Toekomstige apparaten kunnen gebruik maken van microfluïdische kanalen en pompen, om het aantal parallelle injectoren te verhogen, om de grootte te minimaliseren (misschien waardoor dergelijke toestellen te worden gemonteerd op de hoofden van vrij bewegende dieren).
The authors have nothing to disclose.
ESB erkent financiering door New Innovator Award van de NIH directeur (DP2 OD002002-01), NIH Challenge Grant 1RC1MH088182-01, NIH Grote kansen Grant 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0,835,878 en 0,848,804), het McGovern Institute Neurotechnologie Award Programma , het ministerie van Defensie, NARSAD, de Alfred P. Sloan Foundation, Jerry en Marge Burnett, de SFN Research Award for Innovation in Neuroscience, het MIT Media Lab, de Benesse Foundation, en de Wallace H. Coulter Foundation.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Company | 701N | Need one per injection site |
Mouse stereotax | Tool | Stoelting | 51725D | |
Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
0.011″ diameter drill bit for mini mill | Tool | Mcmaster-Carr | 8915A12 | |
1/32″ diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
Dental drill accessories | Tool | Pearson | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 |
|
1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small-Parts | HTX-15R | |
1-72 binding slotted machine screw | Material | Small-Parts | MX-0172B | |
1-72 hex nut | Material | Small-Parts | HNX-0172 | |
PCB proto-board, 1/32″ thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
Acrylic Sheet, 1/8″ thick | Material | Mcmaster-Carr | 8560K239 | |
HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR | 63018-827 |