Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

1. La construcción de Clamp estereotáxica La pinza estereotáxica se usa para sujetar el conjunto inyector a la stereotax, de modo que los inyectores estén paralelos al brazo estereotáxica. Cada laboratorio sólo necesita una pinza, a menos que se prevé que más de una cirugía puede llevarse a cabo de forma simultánea. En este caso, hacer el mismo número que el número máximo previsto de cirugías simultáneas. También puede ser recomendable hacer un extra, en caso de daños a la primera. Para hacer la pinza estereotáxica, en primer lugar, un diámetro de 1,5 mm exterior (OD) cánula de acero se reduce a 2 pulgadas de largo, y uno de los extremos hacia abajo hasta que se Dremeled plana. A continuación, una pequeña porción (aproximadamente 0,5 x 0,5 cm) se corta de PCB proto-board, para ser utilizado como separador. Usando un cortador láser para asegurar que los recortes hechos son perpendiculares a la superficie del material, dos rectángulos iguales (1 / 2 "x 3 / 8") se cortan de 1 / 8 "láminas de acrílico, cada rectángulo que tiene dos agujeros circulares en esquinas opuestas del rectángulo. El primer agujero tiene un diámetro de 1,5 mm, y es lo suficientemente grande como para mantener la cánula de metal bien. El segundo agujero tiene un diámetro de 1 / 16 "(fig. 1C). La cánula de metal se inserta en el orificio de 1,5 mm de un rectángulo, y luego a través del agujero de 1,5 mm de la segunda. El extremo inferior de la cánula está alineado con la cara inferior del rectángulo inferior, adoptando la forma de un palo de hockey. Manteniendo el separador firmemente sostiene, entre los dos rectángulos, esta estructura es unirse entre sí por el uso de pegamento caliente alrededor de los agujeros y cánula de 1,5 mm, teniendo cuidado de evitar pegar el separador de los rectángulos. Plastilina puede ser útil para mantener las cosas en este proceso. Después de que el pegamento se haya secado, un tornillo de 1-72 se inserta en el orificio de 1 / 16 de la parte superior de los rectángulos. A continuación, una tuerca hexagonal 1-72 se enrosca en el extremo del tornillo de 1-72, y se aprieta. El tornillo y la tuerca que sujetan la abrazadera. Para colocar la tuerca de la cara inferior del rectángulo de fondo, una pequeña cantidad de epoxi de 5 minutos se dejan caer por el borde de la tuerca hexagonal, sin permitir que el epoxi para entrar en los hilos de la tuerca hexagonal o tornillo. Cualquier arcilla se extrae, y se confirma que el separador puede ser sostenido firmemente en su lugar apretando el tornillo. 2. Preparación del sistema para la medida amplia de inyección: Hamilton bomba y stereotax El sistema de matriz de inyección pueden ser personalizados para casi cualquier conjunto de coordenadas en el cerebro. El primer usuario localiza las coordenadas de los puntos de inyección deseada en un ratón (o de otras especies) atlas del cerebro, convirtiendo a las coordenadas utilizadas en los stereotax (en este caso, X, Y, y Z-coordenadas). El número de sitios de inyección (tres en las figuras 1A y 1B) en adelante se llamará k. número k de 10 l jeringas Hamilton se colocan en una bomba de jeringa de inyección / retiro como este aparato de la Universidad de Harvard. A continuación, tres metros de largo, pedazos de tubo de polietileno están firmemente adherido a la aguja de cada jeringa Hamilton. Por cada pieza de tubo de polietileno, un F-252 tubos de manga Upchurch Científico se desliza sobre el extremo abierto y conectado a un adaptador de tubo P-627 con la tuerca y el casquillo incluye, además de Upchurch Científico. 3. La construcción de la matriz a medida inyector Cada matriz de inyección se adapta al conjunto de coordenadas que el usuario elija. Sin embargo, para conjuntos de coordenadas que sólo difieren en la traducción y / o rotación, la misma variedad de inyección se pueden utilizar. Considerando sólo el X relativa y las coordenadas Y de los sitios de inyección, los agujeros k se perforan en un PCB proto-board de espesor 1 / 32 ", con la misma distancia relativa. Estos agujeros son perforados con un molino de Modela mini y un .011" de diámetro de broca de McMaster-Carr. Asegúrese de utilizar un ritmo lento de la perforación (Z-velocidad) para evitar la rotura o desgaste de la broca. Antes de retirar la placa de la planta, un rectángulo es perforado alrededor de los agujeros pequeños, con una broca de mayor diámetro de 1 / 32 ", para evitar el uso de la más pequeña del Código para la fábrica de Mini se puede generar fácilmente utilizando MATLAB;. Muestras código se proporciona en los siguientes archivos. generate.m – código de MATLAB para generar código Modela de coordenadas deseadas holes_ex.rml – Modela el código de patrón de timbre de perforación (ocho agujeros) en el proto-board outline_ex.rml – Modela el código de rectángulo alrededor de los agujeros de perforación 245 m OD/100 micras de diámetro interior (ID) tubo capilar de sílice fundida, disponible en las tecnologías de Polymicro, se corta en número k de 3 pedazos de una pulgada. Estos comprenden los inyectores individuales. Una pieza desechable de tubos capilares se asomó a través decada uno de los agujeros, para limpiar los residuos sin obstruir los inyectores real. Los inyectores se inserta a mitad de camino en cada agujero, de modo que se mantienen firmes y paralelas entre sí. Los inyectores son epóxico a la junta, que forman la estructura de la matriz del inyector. Todo lo que queda es ajustar los inyectores a la longitud correcta. La matriz de inyección se une a la pinza estereotáxica mediante la colocación de una esquina de la proto-board entre los rectángulos de acrílico, y luego apretando el tornillo de la abrazadera estereotáxica. A continuación, la cánula metálica de la abrazadera se une a la stereotax, utilizando el mecanismo de fijación de la stereotax. Todos los siguientes se realiza bajo un microscopio. Para uno de los inyectores exterior (es decir, que puede ser abordado desde el lado con un borde recto, sin chocar con alguno de los inyectores de otro tipo), la punta se extiende más allá de la parte inferior de la proto-board se corta con unas tijeras. Para las inyecciones cortical, es apropiado para que el inyector se extiende aproximadamente 5 mm más allá de la superficie de la proto-board. Para más inyecciones, este número puede ser aumentado por el incremento correspondiente en profundidad. La punta es aplanada con una herramienta Dremel. Consejos inyector también puede ser suelo en un ángulo como medida de precaución adicional contra la obstrucción, si la precisión en la profundidad es menos importante. A continuación, un punto de referencia estable que se elija dentro del alcance del brazo estereotáxica, y el conjunto inyector se mueve de manera que la punta plana del exterior del inyector, es en este punto de referencia. Un segundo inyector es elegido, junto con sus correspondientes coordenadas. En cuenta es la diferencia relativa de la altura (z) entre las coordenadas inyector primero y segundo. La matriz de inyección se mueve a lo largo del eje Z en esta distancia relativa. El inyector segundos se corta y Dremeled a la longitud correcta, de modo que la punta del inyector segundo plano y ahora es a la altura del punto de referencia. La matriz de inyección se pueden mover en las direcciones X e Y para facilitar la comparación de la punta del inyector con el punto de referencia. Este proceso de recorte se repite para el resto de los inyectores. 4. Montaje de todo el sistema La pinza estereotáxica y personalizado conjunto inyector, ambos ya construidos, se requieren para esta parte. La parte de atrás de cada inyector (el extremo que no ha sido recortada) se inserta en un azul F-240 y la tubería de manga, con un P-235 tuerca y P-200 casquillos de Upchurch Científico, es conectado al adaptador de rosca ya está conectado a la bomba de Hamilton por la tubería de polietileno. Las instrucciones del fabricante se pueden consultar para más detalles. Usando una aguja de calibre 27, aceite de silicona se inyecta en la parte posterior de las jeringas de Hamilton para que el sistema entero está lleno de la jeringa Hamilton a la punta del inyector, sin burbujas de aire en absoluto. Como las jeringas Hamilton se vuelven a colocar en la bomba de Hamilton, el mayor volumen posible de aceite de silicona se mantiene en las jeringas. Si el experimento requiere más jeringas que la bomba está diseñada para (dos en este caso), las jeringas se pueden colocar pequeños trozos de plástico (por ejemplo, tapas de aguja) para mantenerlos paralelos entre sí, y para asegurarse de que todas las piezas son impulsado por la bomba en la misma medida. O bien, un conjunto de bastidor multi-upgrade se pueden comprar en Harvard Apparatus para almacenar hasta 10 jeringas a la vez. 5. Inyecciones / cirugía El proceso de inyección con inyector de un paralelo es muy similar a la de la inyección con una pipeta única. Es esencial el uso de recarga lenta / infundir las tasas a lo largo de este proceso, ya que rápidamente el bombeo podría poner presión sobre la articulación entre la tubería de grandes y pequeños. Peso máximo recomendado de la tasa: 2 l / min para la carga de virus, y 0,1 l / min para infundir virus. Un ratón anestesiado se coloca en el stereotax, y permanece anestesiado durante todo el experimento. Prepare el ratón, según sea necesario. Por ejemplo, con un bisturí, un solo corte se realiza por la línea media de la piel, de entre los ojos entre las orejas. La piel se estira hacia atrás para exponer el cráneo, y la fascia se limpia. Una pipeta de vidrio tirado se une a la stereotax. Las posiciones de las barras de la oreja se ajustan hasta bregma y lambda están alineados a la misma altura, y para que la línea que conecta ellos es paralelo al eje de la stereotax. Los ejes de la stereotax se orientan de acuerdo con el sistema de coordenadas en el que las coordenadas de la inyección se han calculado. El estereotáxica se pone a cero con la punta de la pipeta de vidrio en el bregma, y ​​luego la punta se coloca ligeramente por encima del cráneo, en la X e Y las coordenadas de uno de los sitios de inyección. Usando un taladro dental, el cráneo debajo de la punta es cuidadosamente comparación de distancia hasta que queda una capa muy delgada de hueso. La pipeta de vidrio puede ser menored y se crió para comprobar que el agujero se perfora se centra en la posición correcta. Usando una aguja de calibre 30, un pequeño trozo de la capa es suave interceptado, en el X-y corregir las coordenadas, de modo que la duramadre se expone. Este agujero debe ser lo suficientemente grande como para ajustarse a uno de los inyectores (0,25 mm de ancho). Ver Figura 1 D para el diagrama. De esta manera, los pequeños agujeros, ancho de 0,25 mm se hacen en el cráneo, en la X e Y las coordenadas correspondientes a cada sitio de la inyección. La pipeta de vidrio se desecha en un contenedor de objetos punzantes, y la medida amplia de inyección se une a la stereotax con la abrazadera estereotáxica. Con el fin de ajustar correctamente el ángulo de la matriz de inyección, inyectores dos exteriores son elegidos para ser calibrados a un punto de referencia determinado, de la siguiente manera. Después de uno de los inyectores se corresponde con el punto de referencia, tenga en cuenta la relación X e Y las distancias entre los puntos de inyección en relación con este inyector y el otro. Los ejes de la stereotax se ajustan de manera que todo el conjunto inyector se mueve en la X e Y las direcciones de estas distancias relativas. Si el inyector segundo no está alineado con el punto de referencia, la cánula de metal se afloja y se gira. Este proceso se repite iterativamente hasta que la matriz de inyección tiene un ángulo correcto. Antes de llenar los inyectores con el virus, los inyectores están llenos de aceite de silicona hasta que las jeringas se encuentran en el punto 2 l (o superior). Esto proporciona una zona de amortiguamiento, por lo que las burbujas de aire o la obstrucción en la punta se puede quitar fácilmente empujando hacia adelante con aceite de la bomba de Hamilton, sin tener que volver a llenar el sistema con aceite de silicona de la parte posterior de las jeringas, como se describe anteriormente. Un trozo de Parafilm estéril se coloca en el cráneo, y los inyectores son ligeramente baja en el Parafilm. Para las coordenadas con profundidades muy variables, una costumbre elaborado: una parte (por ejemplo, un objeto con forma de escalera) pueden facilitar la carga. Las partes siguientes se supone que uno de l virus se va a cargar en cada lugar (las siguientes cantidades deben reducirse si se desean cantidades más pequeñas). Con el fin de garantizar que> 1 l de virus se inyecta en cada sitio, de 1,5 l de virus es pipeta en el Parafilm o escalera en la punta de cada inyector. Con la tasa de recambio de la bomba de Hamilton pone a 1 l / min, 1,2 l de que el virus se vuelve a llenar en cada inyector. La punta de los más largos del inyector se pone a cero en el bregma, a continuación, la matriz de inyección se desplaza a la X e Y las coordenadas de ese inyector. Si la obstrucción es un problema, dicen que si muchos objetivos profundos están involucrados: incluso antes de insertar las puntas de inyección en el cerebro, a veces es aconsejable comenzar la infusión de la bomba, hasta que el virus se puede ver que salen de todos los consejos del inyector. Esto elimina las burbujas de aire en la punta del inyector, y también asegura que no se atasque. En el caso de la obstrucción, la bomba de Hamilton se encuentra a infundir un breve pulso a una velocidad mayor de 2 l / min, para limpiar suavemente la obstrucción. La matriz de inyección se hace descender, a través de los pequeños orificios hechos con las agujas de calibre 30, a la correcta Z-profundidad. 1 l de virus es inyectado a través de cada inyector, a 0,1 l / min. Las inyecciones se quedan solos durante 30 minutos. Después de la matriz inyector extrae lentamente desde el cerebro, la bomba de Hamilton está en infundir a la misma tasa de 0,1 l / min, con el fin de comprobar si la obstrucción en cada inyector. A continuación, los inyectores se limpian por la reposición y la infusión de 1,5 l de etanol a 2 l / min. Finalmente, los inyectores se rellenan con aceite de silicona para mantener la zona de amortiguación 2 l de cada jeringa Hamilton. Todo el equipo debe ser esterilizado antes y después del procedimiento, de acuerdo con la bioseguridad de su institución y los protocolos de uso animal. 6. Resultados representante El paralelo conjunto inyector acelera una cirugía más o menos por un factor igual a la cantidad de inyectores, sin contar la instalación y el tiempo de recuperación, aunque los tiempos individuales dependerá de la habilidad del médico. Para una inyección de 1 microlitro, por lo general ver la expresión de lentivirus en una esfera de aproximadamente 1 mm de diámetro (Fig. 1E). La precisión de la inyección era tal que la variabilidad en el posicionamiento de la punta, a partir de los ensayos, fue de aproximadamente 45 micras (desviación estándar de la distancia desde la posición de la punta a la posición de punta de la intención). Figura 1. Diseño, implementación y uso de un virus en paralelo serie inyector. Un esquema, del sistema de matriz paralela inyector, mostrando una triple configuración de los inyectores, por tres inyecciones simultáneas. B, la fotografía de una matriz de tres paralelos de inyección como en el diagrama de un . <stRong> C, abrazadera estereotáxica, que se muestra en líneas generales desde la parte superior D, la ilustración de la técnica para una eficiente, minimizando el daño-, la apertura de agujeros en el cráneo para inyector de inserción en el cerebro:. con un taladro dental, delgada del cráneo hasta espesor de ~ 50 micrones, a continuación, utilizar la punta de una aguja para abrir una pequeña craneotomía. E, que muestra imágenes de fluorescencia canalrodopsina-2 (ChR2)-GFP-etiquetados células en tres regiones corticales del ratón, como se había previsto por la triple serie de inyección se muestra en la B.