تحجيم Fluidic صالحة للحقن الفيروسية استهداف سليمة دوائر الدماغ 3 - D
Summary
مراقبة وتحليل الدوائر العصبية<em> في الجسم الحي</emو> يتيسر من التكنولوجيا لتسليم فيروسات والكواشف الأخرى ليحدد 3 الابعاد المرجوة من مناطق الدماغ. نظهر مجموعة مخصصة حاقن fluidic تصنيع وتسليم فيروسي ترميز المحسسات الضوئية ، مما يمكن التلاعب البصرية للدوائر الدماغ المعقدة.
Abstract
فهمنا من الدارات العصبية — الطريقة التي توسط في العمليات الحسابية التي أيد الإحساس والفكر والعاطفة ، والعمل ، وكيف أنها معطوبة في الاضطرابات العصبية والنفسية — وسوف يسهل كثيرا من التكنولوجيا لاستهداف الجينات بسرعة إلى 3 المعقدة — الدوائر العصبية الأبعاد ، مما خلق السريع لل"المعدلة وراثيا على مستوى الدوائر." وقد طورنا أساليب مؤخرا في الفيروسات التي ترميز البروتينات الحساسة للضوء يمكن توعية أنواع معينة من الخلايا لتنشيط مقياس ميلي ثانية واحدة ، وإسكات في الدماغ سليمة. نعرض هنا تصميم وتنفيذ مجموعة حاقن القادرة على إيصال الفيروسات (أو سوائل أخرى) لعشرات من نقاط محددة داخل الهيكل 3 الأبعاد للدماغ (<strong> الشكل. 1A ، 1B</strong>). الصفيف تضم حاقن مضخات التشريد واحد أو أكثر من أن كل مجموعة من محرك الحقن ، كل منها تغذي السيليكا تنصهر – بوليميد / الشعرية عبر موصل الضغط العالي للملوحة. الشعيرات الدموية والحجم ، وإدراجه في ذلك الحين ، الأماكن المطلوبة التي حددها العرف الطحن لوحة المواقع المجسم ، وبالتالي السماح ليتم تسليمها الفيروسات أو الكواشف الأخرى لمجموعة المرجوة من مناطق الدماغ. لاستخدام الجهاز ، جراح يملأ أولا الفرعي fluidic تماما مع النفط ، backfills الشعيرات الدموية مع الفيروس ، وإدراج الجهاز في الدماغ ، وينفخ الكواشف ببطء (<0.1 microliters / دقيقة). طبيعة موازية للصفيف حاقن يسهل وضع العلامات السريع ودقيقة وقوية من الدوائر العصبية بأكملها مع الحمولات الفيروسية مثل الحساسية الضوئية لتمكين ضوء التنشيط وإسكات دوائر الدماغ محددة. جنبا إلى جنب مع غيرها من التقنيات ، مثل المصفوفات الألياف البصرية لإيصال الضوء إلى مجموعات المرجوة من مناطق الدماغ ، ونأمل في خلق الأدوات التي تمكن من منهجية التحقيق وظائف السببية العصبية في الدماغ سليمة. قد لا تفتح هذه التكنولوجيا فقط تصل إلى مثل هذه الأساليب المنهجية التي تركز على حلبة علم الأعصاب في الثدييات ، وتسهيل وضع العلامات على مناطق المخ في الحيوانات الكبيرة مثل الرئيسيات غير البشرية ، ولكن أيضا قد فتح طريقا السريرية متعدية لخلية محددة تحكم الاصطناعية البصرية ، قد الدقة التي تمكن من تحسين علاج اضطرابات الدماغ المستعصية. أخيرا ، قد مثل هذه الأجهزة كما هو موضح هنا على وجه التحديد في توقيت غير مناسب تسهيل تسليم fluidic حمولات أخرى مثل الخلايا الجذعية وكلاء الدوائية ، إلى 3 هياكل الأبعاد ، بطريقة بسهولة من قبل المستخدم للتخصيص.
Protocol
Discussion
في السنوات الأخيرة ، ومكنت عددا من راثيا ترميز المحسسات الضوئية إلى تنشيط الخلايا العصبية وإسكاتها في الجسم الحي بطريقة دقيقة ، زمنيا ، ردا على نبضات قصيرة من الضوء (على سبيل المثال ، 1،4،5،6،7،8 ، 11). وهناك طريقة أساسية مع الخلايا العصبية التي جرت توعية الضوء في المخ لدى الثدييات ، هو عن طريق الفيروسات مثل lentiviruses والغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) ، والتي يمكن تقديم الجينات ترميز opsins لأدمغة الحيوانات تتراوح من الفئران إلى القرود ، في آمنة ودائمة أزياء (على سبيل المثال ، 2،9،10). فيروسات تسمح أسرع فترة زمنية من القيام المعدلة وراثيا ، وخاصة بالنسبة للكائنات الحية التي ليست نموذجية وراثية مثل الفئران والقرود ، وربما تمكن opsins مستويات التعبير العالية التي قد لا يكون ممكنا في سيناريوهات المعدلة وراثيا. هنا نظهر مجموعة حاقن موازية قادرة على خلق ، في فترة زمنية سريعة "على مستوى الدوائر المعدلة وراثيا" ، مما يمكن من الهياكل الدماغ بأكمله 3 الابعاد تستهدف فيروسي مع الجينات ، في خطوة واحدة جراحية. الصفيف تضم حاقن مضخات التشريد واحد أو أكثر من أن كل مجموعة من محرك الحقن ، كل منها تغذي السيليكا تنصهر – بوليميد / الشعرية عبر موصل الضغط العالي للملوحة. الشعيرات الدموية والحجم ، وإدراجه في ذلك الحين ، الأماكن المطلوبة التي حددها العرف الطحن لوحة المواقع المجسم ، وبالتالي السماح ليتم تسليمها الفيروسات أو الكواشف الأخرى لمجموعة المرجوة من مناطق الدماغ. لاستخدام الجهاز ، جراح يملأ أولا الفرعي fluidic تماما مع النفط ، backfills الشعيرات الدموية مع الفيروس ، وإدراج الجهاز في الدماغ ، وينفخ الكواشف ببطء (<0.1 ميكرولتر / دقيقة).
وسوف تمكن هذه التكنولوجيا طائفة واسعة من أنواع جديدة من التجارب ، مثل ميلي ثانية واحدة ، مقياس اغلاق التعقيد على شكل هياكل (مثل الحصين) في أوقات محددة أثناء السلوك ، تعطيل مؤقتا – الدقيق للهياكل الثنائية التي قد تعمل redundantly (مثل اللوزة اليمنى واليسرى) ، واضطراب من مناطق الدماغ منفصلة متعددة (على سبيل المثال ، والقيادة منطقتين متصلا من مرحلة دراسة كيفية التزامن عبر المنطقة يعتمد على النشاط داخل كل منطقة ، أو تحفيز المدخلات إلى المنطقة في الوقت الذي إسكات مجموعة فرعية من هذه الأهداف من أجل أن نفهم أي من عدة اهداف حاسمة للوساطة من آثار تلك المدخلات). لأدمغة كبيرة مثل تلك الموجودة في المدن الرئيسية ، والتي أثبتت لنا مؤخرا خلية نوع محدد التنشيط العصبي البصري 3 ، الاقلاق النشاط في منطقة سلوكيا ذات الصلة قد تتطلب وضع العلامات الفيروسية الهياكل الكبيرة والمعقدة. نلاحظ أنه يمكن استخدام موازية صفائف محقن لحقن أي ما يقرب من حمولة — المخدرات ، neuromodulators ، العصبية ، أو خلايا من ذلك — في أنماط 3 – D معقدة في الدماغ ، بطريقة دقيقة ، زمنيا. أخيرا ، من وجهة نظر متعدية ، فمن الممكن أن سرعة ، والعلاج الجيني للمرضى أو أجهزة مخصصة لتقديم الأدوية قد تكون سريعة صممت خصيصا لتتناسب وملفقة هندستها الدماغ الفردية ، ودعم علاجات جديدة لمجموعة متنوعة من الأمراض ، ومن المحتمل من خلال استخدام مراقبة الجزيئات الضوئية.
وقد صممت هذه المصفوفات حاقن على وجه الدقة ، مكانيا وvolumetrically. في X – Y – والاتجاهات ، ويتم ذلك من خلال حفر ثقوب دقيقة جدا وضعها غير مكلفة باستخدام طاحونة صغيرة ، مع فتحات كبيرة بما يكفي لاحتواء عن طريق الحقن ، وذلك عن طريق الحقن التي تقام بالتوازي مع بعضها البعض ، وفي الدقيقة الموقع. في Z – الاتجاه ، يتم قطع طريق الحقن باستخدام جهاز التجسيمي ، والسماح لمستوى الدقة يعادل ذلك من الجراحة نفسها التجسيمي. دقة الحجمي ينبع من دقة مضخة هاملتون ، وكذلك بالقرب من الصفر ميتا حجم الموصلات ، وتكييفها من اللوني السائل ذات الضغط العالي (HPLC) الحقل. تتم عن طريق الحقن من الأنابيب الشعرية السيليكا تنصهر فيها ، والتي هي قوية وصلبة بما فيه الكفاية أنه يحافظ على الشكل الدقيق والمباعدة بين الولادات تحت الضغط ، دون أن يكون سمك الجدار أكبر من البدائل مثل cannulas الصلب. ويمكن بسهولة أن يتم اجراء تعديلات بسيطة على التكيف مع الصفيف حاقن موازية لمجموعة متنوعة من التجارب. على سبيل المثال ، إذا كان المطلوب أصغر حجم فيروس أو تباعد أكثر دقة ، يمكن استخدام أنابيب أصغر الشعرية ، جنبا إلى جنب مع أصغر قليلا المقابلة الحفر. قد تستخدم في المستقبل أجهزة ميكروفلويديك قنوات ومضخات ، لزيادة عدد الحقن بالتوازي مع ذلك ، للتقليل من حجم (تمكين ربما تكون مثل هذه الأجهزة المركبة على رؤوس الحيوانات ، بحرية التحرك).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ESB يقر تمويل من جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة ومبتكر جديد (DP2 OD002002 – 01) ، NIH التحدي المنح 1RC1MH088182 – 01 ، NIH جراند فرص المنح 1RC2DE020919 – 01 ، NIH 1R01NS067199 – 01 ، جبهة الخلاص الوطني (0835878 و 0848804) ، وجائزة ماكغفرن Neurotechnology معهد برنامج وزارة الدفاع ، NARSAD ، ومؤسسة ألفريد بي سلون ، وجيري مارج بورنيت ، وجائزة بحوث SFN للإبداع في العلوم العصبية ، وسائل الإعلام مختبر معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، ومؤسسة Benesse ، وحاء كولتر والاس مؤسسة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
| Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
| Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
| Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
| 10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Company | 701N | Need one per injection site |
| Mouse stereotax | Tool | Stoelting | 51725D | |
| Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
| 0.011″ diameter drill bit for mini mill | Tool | Mcmaster-Carr | 8915A12 | |
| 1/32″ diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
| High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
| Dental drill accessories | Tool | Pearson | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 |
|
| 1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small-Parts | HTX-15R | |
| 1-72 binding slotted machine screw | Material | Small-Parts | MX-0172B | |
| 1-72 hex nut | Material | Small-Parts | HNX-0172 | |
| PCB proto-board, 1/32″ thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
| Acrylic Sheet, 1/8″ thick | Material | Mcmaster-Carr | 8560K239 | |
| HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
| Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
| 5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
| Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR | 63018-827 |
References
- Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).
- Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. Neuron. 50, 23-33 (2006).
- Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain. Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).
- Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).
- Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
