Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

1. Der Bau Stereotaktische Clamp Die stereotaktische Klammer zur Befestigung der Injektor-Array mit dem stereotax verwendet, so dass die Injektoren parallel zur stereotaktischen Arm sind. Jedes Labor muss nur eine Klammer, es sei denn, es wird erwartet, dass mehr als eine Operation kann gleichzeitig stattfinden. In diesem Fall machen die gleiche Nummer wie die zu erwartende maximale Anzahl der gleichzeitigen Operationen. Es könnte auch ratsam, eine zusätzliche machen, im Falle von Schäden an der ersten. Um die stereotaktische Klemme, erstens, ist ein 1,5 mm Außendurchmesser (OD) Stahlkanüle bis 2 cm in der Länge geschnitten, und eines der Enden nach unten, bis flach Dremeled. Als nächstes wird ein kleines Stück (ca. 0,5 x 0,5 cm) aus PCB proto-board geschnitten, um als Abstandshalter verwendet werden. Mit Hilfe eines Laser-Cutter, um sicherzustellen, dass alle Schnitte senkrecht zur Oberfläche des Materials, sind zwei identische Rechtecke (2.1 "x 3 / 8") von 1 / 8 "Acryl Folien, jedes Rechteck mit zwei kreisrunde Löcher in Schnitt gegenüberliegenden Ecken des Rechtecks. Das erste Loch hat einen Durchmesser 1,5 mm, und ist gerade groß genug, um die Metallkanüle festhalten. Das zweite Loch hat einen Durchmesser 1 / 16 "(Abbildung 1C). Die Metall-Kanüle wird in die 1,5 mm Loch von einem Rechteck eingefügt, dann durch die 1,5 mm Bohrung des zweiten. Das untere Ende der Kanüle ist mit der Unterseite des unteren Rechtecks ​​ausgerichtet und bildet die Form eines Hockey-Schläger. Halten Sie die Abstandhalter fest zwischen die beiden Rechtecke statt, ist diese Struktur zusammen mit Heißkleber rund um die Kanüle und 1,5 mm Löcher zementiert, wobei darauf zu vermeiden, kleben Sie den Abstandhalter an den Rechtecken. Knetmasse kann hilfreich sein, Dinge zusammen zu halten während dieses Prozesses. Nachdem der Leim getrocknet ist, ist ein 1-72 Schraube in den 1 / 16 Loch von der Oberseite der Rechtecke eingefügt. Dann wird eine 1-72 Sechskantmutter wird auf das Ende der 1-72 Schraube eingedreht und festgezogen. Die Schraube und Mutter dazu dienen, die Klammer zusammenhalten. Zur Befestigung der Sechskantmutter an der Unterseite des unteren Rechtecks, kleine Mengen von 5-Minuten-Epoxy sind um den Rand der Sechskantmutter gesunken, ohne dass das Epoxidharz in das Gewinde der hex Mutter oder Schraube zu bekommen. Jede Modelliermasse wird entfernt, und es wird bestätigt, dass der Abstandhalter fest an seinem Platz kann durch Anziehen der Schraube gehalten werden. 2. Vorbereiten des Systems für die individuelle Injektor Array: Hamilton Pumpe und stereotax Der Injektor-Array-System kann an nahezu jedem Satz von Koordinaten in das Gehirn angepasst werden. Der Benutzer zuerst lokalisiert Koordinaten des gewünschten Injektionsstellen in eine Maus (oder andere Arten) Hirnatlas, die Umstellung auf den entsprechenden Koordinaten der stereotax verwendet (hier X-, Y-und Z-Koordinaten). Die Zahl der Injektionsstellen (drei in den Figuren 1A und 1B) wird im Folgenden als k sein. k-Zahl von 10 ul Hamilton Spritzen sind in einer Injektion / Entnahme Spritzenpumpe wie diese von der Harvard Gerät gestellt. Next, 3-Fuß-lange Stücke aus Polyethylen-Schlauch fest mit der Nadel eines jeden Hamilton-Spritze befestigt. Für jedes Stück aus Polyethylen-Schlauch, eine F-252-Schlauch Manschette aus Upchurch Scientific ist über das offene Ende geschoben und an eine P-627 Schlauchadapter mit der mitgelieferten Mutter und Ferrule, auch von Upchurch Scientific. 3. Die Konstruktion der Customized Injector Array Jeder Injektor Array wird der Satz von Koordinaten, die der Benutzer angepasst werden. Doch für Sätze von Koordinaten, die nur durch eine Übersetzung und / oder Rotation unterscheiden, kann die gleiche Düse Array verwendet werden. Betrachtet man nur die relative X-und Y-Koordinaten der Injektionsstelle, sind k Löcher in eine PCB proto-board mit einer Dicke von 1 / 32 gebohrt ", mit dem gleichen Abstand zueinander. Diese Bohrlöcher werden mit einem Modela Mini-Mühle und eine 0,011" Durchmesser Bohrer von der McMaster-Carr. Achten Sie darauf, eine langsame Bohren (Z-Geschwindigkeit) nutzen, um zu vermeiden brechen oder Verschleiß des Bohrers. Vor dem Entfernen der Karte aus der Mühle, ist ein Rechteck um die kleinen Löcher gebohrt, mit einem größeren Bohrer mit einem Durchmesser von 1 / 32 ", zu vermeiden, tragen die kleineren Code für die Mini-Mühle erzeugt wird, kann leicht mit Hilfe von MATLAB werden;. Probe Code ist in den folgenden Dateien zur Verfügung gestellt. generate.m – MATLAB-Code zur Erzeugung Modela Code gewünschten Koordinaten holes_ex.rml – Modela Code für das Bohren Ruftonmuster (acht Löcher) in Proto-Board outline_ex.rml – Modela Code für das Bohren Rechteck um Löcher 245 um OD/100 um Innendurchmesser (ID) Quarzglaskapillare Schlauch, erhältlich von Polymicro Technologies, ist in k Anzahl von 3 cm große Stücke schneiden. Diese umfassen die einzelnen Injektoren. Ein Einweg-Stück Kapillarrohr wird durch stochertejedes der Löcher, zu beseitigen Schmutz, ohne zu verstopfen die tatsächliche Injektoren. Die Injektoren sind dann zur Hälfte in jedes Loch gesteckt, so dass sie dicht und parallel zueinander gehalten. Die Injektoren sind in den Vorstand geklebt und bildet die Struktur der Injektor-Array. Was bleibt, ist die Injektoren auf die richtige Länge zu trimmen. Der Injektor-Array ist die stereotaktische Klemme, indem Sie eine Ecke des proto-board zwischen den Acryl-Rechtecke angebracht ist, und dann durch Anziehen der Schraube der stereotaktischen Klemme. Als nächstes wird die Metallkanüle der Klemme, die stereotax befestigt, mit dem Befestigungsmechanismus der stereotax. Alle folgenden wird unter dem Mikroskop durchgeführt. Für einen der äußeren Einspritzdüsen (das heißt, eines, das von der Seite mit einer geraden Kante angefahren werden kann, ohne anzustoßen in keine der anderen Injektoren), ist die Spitze, die über den Boden des Proto-Board mit einer Schere abgeschnitten. Für kortikale Injektionen, ist es angebracht, die Injektor sich etwa 5mm über der Oberfläche des proto-board. Für tiefere Injektionen, kann diese Zahl durch die entsprechende Erhöhung in der Tiefe erhöht werden. Die Spitze ist mit einem Dremel abgeflacht. Injector Tipps können auch geschliffen werden in einem Winkel als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme gegen Verstopfung, wenn Präzision in der Tiefe ist weniger wichtig. Als nächstes wird ein stabiler Bezugspunkt innerhalb der Reichweite der stereotaktischen Arm gewählt, und der Injektor-Array wird verschoben, so dass die abgeflachte Spitze des äußeren Injektor, bei dieser Bezugspunkt ist. Ein zweiter Injektor ist so gewählt, zusammen mit den entsprechenden Koordinaten. Betrachtet wird der relative Unterschied in der Höhe (z-Richtung) zwischen dem ersten und zweiten Injektor Koordinaten. Der Injektor-Array ist entlang der Z-Achse durch diese relative Distanz bewegt. Die zweite Einspritzdüse wird beschnitten und Dremeled auf die richtige Länge, so dass die Spitze des zweiten Injektor ist jetzt flach und auf der Höhe des Bezugspunktes. Der Injektor-Array kann in der X-und Y-Richtung bewegt werden, um gegenüber der Injektorspitze mit dem Bezugspunkt zu erleichtern. Dieser Prozess der Besatz ist für die restlichen Injektoren wiederholt. 4. Montage des gesamten Systems Die stereotaktische Klemme und maßgeschneiderte Injektor-Array, beide bereits gebaut, sind für diesen Teil benötigt. Das hintere Ende eines jeden Injektors (Ende, der bisher nicht beschnitten) ist in einen blauen F-240-Schlauch Manschette und mit Hilfe eines P-235 Nuss-und P-200 Zwinge aus Upchurch Scientific eingefügt wird, wird auf den Gewindeadapter bereits angeschlossen befestigt die Hamilton-Pumpe durch PE-Rohre. Die Anweisungen des Herstellers kann für weitere Details eingesehen werden. Mit einer 27-Gauge-Nadel wird Silikonöl in die Rückseite des Hamilton-Spritzen so dass das gesamte System aus dem Hamilton-Spritze ist es, die Injektorspitze gefüllt injiziert, ohne Luftblasen überhaupt. Als Hamilton Spritzen sind in der Hamilton-Pumpe neu platziert, ist das größtmögliche Volumen von Silikonöl in die Spritzen erhalten. Wenn das Experiment erfordert mehr Spritzen als die Pumpe für (zwei in diesem Fall) ist so konzipiert, kann das Spritzen mit kleinen Stücken aus Kunststoff (z. B. Nadel caps) angeordnet werden, damit sie parallel zueinander, und dafür zu sorgen, dass alle Stücke sind getrieben von der Pumpe im gleichen Umfang. Oder Sie können ein Multi-Rack-Upgrade-Kit von Harvard Apparatus erworben werden, um bis zu 10 Spritzen auf einmal. 5. Injektionen / Chirurgie Der Prozess der Injektion mit einem parallel Injektor ist sehr ähnlich dem der Injektion mit einer einzigen Pipette. Es ist wichtig, langsam nachfüllen verwenden / Infusion Raten während dieses Prozesses, denn schnelle Pumpen könnten Druck auf das Gelenk zwischen großen und kleinen Schlauch gelegt. Empfohlene max Geschwindigkeit: 2 ml / min für das Laden-Virus, und 0,1 ml / min zur Infusion Virus. Einer narkotisierten Maus ist in der stereotax gesetzt und bleibt während des gesamten Versuchs betäubt. Bereiten Sie die Maus nach Bedarf. Zum Beispiel mit einem Skalpell wird ein einziger hieb die Mittellinie der Haut gemacht, zwischen den Augen, zwischen den Ohren. Die Haut wird wieder auf den Schädel freizulegen, und die Faszie zu reinigen. A gezogen Glaspipette auf die stereotax befestigt. Die Positionen des Ohres Bars sind so eingestellt, bis Bregma und Lambda auf die gleiche Höhe ausgerichtet sind, und so, dass die Verbindungslinie zwischen ihnen ist parallel zur Y-Achse des stereotax. Die Achsen der stereotax sind nach dem Koordinatensystem, in dem die Injektion Koordinaten berechnet wurden orientiert. Die stereotaktische ist mit der Spitze der Glaspipette auf Bregma Null und dann die Spitze liegt leicht über dem Schädel an der X-und Y-Koordinaten von einem der Injektionsstelle positioniert. Mit Hilfe eines zahnärztlichen Bohrers, der Schädel ist unterhalb der Spitze sorgfältig weg, bis es bleibt eine extrem dünne Schicht des Knochens verglichen. Die Glaspipette kann geringer seined und angehoben, um zu überprüfen, dass das Loch gebohrt an der richtigen Stelle zentriert ist. Mit einer 30-Gauge-Nadel, ein kleines Stück der Schicht wird vorsichtig aus, um die richtige X-und Y-Koordinaten, nahm, so dass die Dura mater freigelegt ist. Dieses Loch sollte gerade groß genug, um einer der Injektoren (0,25 mm breit) passen. Siehe Abbildung 1D für Diagramm. Auf diese Weise sind klein, 0,25 mm große Löcher in den Schädel, beim X-und Y-Koordinaten, die jeweils an der Injektionsstelle. Die Glaspipette wird in einem Entsorgungsboxen verworfen, und die individuelle Injektor Array wird an die stereotax angebracht mit der stereotaktischen Klemme. Um korrekt den Winkel des Injektors Array sind zwei äußeren Injektoren ausgewählt, um zu einem bestimmten Referenzpunkt kalibriert werden, wie folgt. Nach einer der Injektoren mit dem Referenzpunkt abgestimmt ist, betrachten die relative X-und Y-Abstände zwischen den Injektionen relativ zu diesem Injektor und einem anderen. Die Achsen der stereotax sind so eingestellt, dass gesamte Injektor-Array ist in der X-und Y-Richtung durch diesen relativen Abstände verschoben. Wenn der zweite Injektor ist jetzt nicht mit dem Bezugspunkt ausgerichtet, ist die Metallkanüle gelockert und gedreht werden. Dieser Prozess ist iterativ, bis der Injektor-Arrays richtig abgewinkelt wird wiederholt. Vor dem Füllen der Injektoren mit einem Virus, sind die Injektoren mit Silikonöl gefüllt, bis die Spritzen an der 2 ul Punkt (oder mehr) sind. Dies stellt eine Pufferzone, so dass Luftblasen oder Verstopfungen in der Spitze leicht, indem Öl nach vorne mit dem Hamilton-Pumpe, ohne Nachfüllen des gesamten Systems mit Silikonöl von der Rückseite der Spritzen, wie zuvor beschrieben, entfernt werden. Eine sterile Stück Parafilm ist auf dem Schädel platziert, und die Injektoren sind leicht auf den Parafilm gesenkt. Für Koordinaten mit sehr unterschiedlichen Tiefen, ein Brauch-Frästeil (z. B. eine Treppe Gebilde) erleichtern könnte loading. Die folgenden Teile davon ausgehen, dass 1 ul Virus an jedem Standort geladen werden (die folgenden Mengen sollten verkleinert werden, wenn kleinere Mengen gewünscht werden) ist. Um zu gewährleisten, dass> 1 ul des Virus an jedem Standort eingespritzt wird, beträgt 1,5 ul des Virus auf den Parafilm oder Treppe an der Spitze eines jeden Injektors pipettiert. Mit dem Nachfüllen von dem Hamilton-Pumpe auf 1 ml / min, beträgt 1,2 ul des Virus in jedem Injektor wieder aufgefüllt. Die Spitze des längsten Injektor ist bei Bregma Null, und dann den Injektor Array wird an die X-und Y-Koordinaten dieser Injektor verschoben. Wenn Verstopfung ist ein Problem, sagen, wenn viele tiefe Ziele beteiligt sind: Schon vor dem Einlegen der Injektor Spitzen in das Gehirn, ist es manchmal ratsam, die Pumpe die Infusion zu starten, bis Viren zu erkennen, die sich aus all den Injektor Tipps. Dies entfernt die Luftblasen in den Injektor Tipps und sorgt dafür, dass es keine Verstopfung. Im Falle einer Verstopfung wird der Hamilton-Pumpe auf einen kurzen Puls mit einer höheren Geschwindigkeit von 2 ml / min ziehen lassen, vorsichtig ausräumen zu verstopfen. Der Injektor Array wird dann abgesenkt, durch die kleinen Löcher mit der 30-Gauge-Nadeln aus, um die richtige Z-Tiefe. 1 ul-Virus wird durch jeden Injektor, bei 0,1 ml / min. Die Injektionen werden allein für 30 Minuten verlassen. Nach dem Injektor-Array wird langsam aus dem Gehirn extrahiert, die Hamilton-Pumpe eingestellt mit der gleichen Rate von 0,1 ml / min ziehen lassen, um für Verstopfungen in jedem Injektor überprüfen. Dann werden die Injektoren sind durch Nachfüllen und Infusion von 1,5 ul Ethanol bei 2 ml / min gereinigt. Schließlich sind die Injektoren mit Silikonöl gefüllt, um die 2 ul Pufferzone in jedem Hamilton-Spritze aufrecht zu erhalten. Alle Geräte sollten vor und nach dem Eingriff sterilisiert werden, je nach Ihrer Institution Biosicherheit und Nutzung von Tieren Protokolle. 6. Repräsentative Ergebnisse Die parallel Injektor Array beschleunigt eine Operation etwa um den Faktor gleich der Anzahl von Injektoren, nicht mitgerechnet Setup-und Recovery-Zeit, auch wenn einzelne Mal von der Geschicklichkeit des Behandlers abhängig ist. Für eine 1 Mikroliter Injektion, wir in der Regel sah Lentivirus Ausdruck in eine Sphäre von ca. 1mm Durchmesser (Abb. 1E). Die Präzision der Injektion war so, dass die Variabilität in der Spitze positioniert, von Versuch zu Versuch, war etwa 45 Mikrometer (Standardabweichung der Abstand von der Spitze der Lage, die beabsichtigten Position der Spitze). Abbildung 1. Design, Implementierung und Verwendung eines parallel Virus Injektor-Array. A, schematische Darstellung des parallel Injektor-Array-System, die eine Dreifach-Injektor-Konfiguration, für drei gleichzeitige Injektionen. B, Foto von einem dreifachen parallel Injektor Array als in A diagrammed . <strong> C, stereotaktischen Klemme, in Umrissen von oben gezeigt, D, Illustration der Technik für die effiziente, Schaden-Minimierung, Öffnung der Löcher im Schädel für Injektor Einsetzen in Gehirn:. mit einem zahnärztlichen Bohrer, dünnen Schädel bis auf ~ 50 Mikron dick, dann verwenden Sie der Spitze einer spitzen Nadel eine kleine Kraniotomie öffnen. E-, Fluoreszenz-Bild zeigt Channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-markierten Zellen in drei Maus-kortikalen Regionen, wie die Dreifach-Injektor Array gezielt in B gezeigt