Contrôle et analyse des circuits neuronaux<em> In vivo</em> Serait facilitée par une technologie pour la prestation des virus et autres réactifs pour désirée en 3 dimensions des ensembles de régions cérébrales. Nous démontrons la fabrication personnalisée fluidiques array injecteur, et la livraison de viro-codés sensibilisateurs optiques, permettant la manipulation optique des circuits cérébraux complexes.
Notre compréhension des circuits neuronaux – comment ils arbitrer les calculs que cette sensation subserve, la pensée, l'émotion et l'action, et comment ils sont corrompus dans les troubles neurologiques et psychiatriques – serait grandement facilitée par une technologie de cibler rapidement les gènes de 3 complexes – dimensions circuits neuronaux, permettant la création rapide de "niveau circuit transgéniques." Nous avons récemment développé des méthodes d'encodage dans lequel des virus sensibles à la lumière des protéines peuvent sensibiliser les types de cellules spécifiques à la milliseconde-calendrier d'activation et de réduire au silence dans le cerveau intact. Nous présentons ici la conception et la mise en œuvre d'un tableau d'injection capable de délivrer des virus (ou d'autres liquides) à des dizaines de points définis au sein de la structure en 3 dimensions du cerveau (<strong> Figure. 1A, 1B</strong>). Le tableau injecteur comprend un ou plusieurs pompes volumétriques que chaque lecteur un ensemble de seringues, dont chacun se nourrit dans un verre de silice-polyimide / capillaire via un connecteur haute pression tolérant. Les capillaires sont de taille, puis inséré dans, endroits désirés spécifiés par la coutume, un conseil de fraisage positionnement stéréotaxique, permettant ainsi à des virus ou d'autres réactifs pour être livré à l'ensemble des régions du cerveau désirée. Pour utiliser l'appareil, le chirurgien remplit d'abord le sous-système fluidique entièrement avec de l'huile, des remblais des capillaires avec le virus, insère le dispositif dans le cerveau, et infuse lentement réactifs (<0,1 microlitres / min). La nature parallèle du tableau injecteur facilite l'étiquetage rapide, précis et robuste de l'ensemble des circuits neuronaux avec des charges virales comme sensibilisateurs optiques pour permettre à la lumière d'activation et au silence des circuits cérébraux définis. Avec d'autres technologies, telles que des tableaux de fibre optique pour la livraison de lumière à des ensembles souhaités de régions du cerveau, nous espérons créer une boîte à outils qui permet à la systématique de palpage de causalité fonctions neuronales dans le cerveau intact. Cette technologie peut non seulement ouvrir un tel approches systématiques au circuit axé sur les neurosciences chez les mammifères, et de faciliter l'étiquetage des régions du cerveau chez les gros animaux comme les primates non-humains, mais peut aussi ouvrir une voie clinique translationnelle pour les cellules spécifiques des prothèses de contrôle optique , dont la précision peut permettre l'amélioration du traitement des troubles du cerveau réfractaire. Enfin, des dispositifs tels que décrits ici peuvent faciliter justement au moment opportun la livraison fluidique d'autres charges utiles, comme les cellules souches et les agents pharmacologiques, à 3 dimensions des structures, de manière facilement personnalisables par l'utilisateur.
Ces dernières années, un certain nombre d'organismes génétiquement codés sensibilisateurs optiques ont permis neurones à être activé et fait taire in vivo d'une manière temporellement précise, en réponse à des impulsions brèves de lumière (par exemple, 1,4,5,6,7,8 , 11). Une méthode clé avec laquelle les neurones ont été sensibilisés à la lumière dans le cerveau des mammifères, se fait par des virus tels que les lentivirus et virus adéno-associés (AAV), qui peuvent délivrer des gènes codant pour des opsines au cerveau des animaux allant des souris aux singes, dans un manière sûre et durable (par exemple, 2,9,10). Virus laisser le temps d'exécution plus rapide que ne le font les transgéniques, en particulier pour les organismes qui ne sont pas des organismes modèles génétiques comme les rats et les singes, et pour opsines peut permettre des niveaux d'expression élevés qui peuvent ne pas être possible dans des scénarios transgéniques. Ici nous démontrons une gamme parallèle injecteur capable de créer, dans un délai rapide ", au niveau circuit transgéniques», permettant à l'ensemble des structures du cerveau en 3 dimensions pour être viralement ciblée d'un gène, en une seule étape chirurgicale. Le tableau injecteur comprend un ou plusieurs pompes volumétriques que chaque lecteur un ensemble de seringues, dont chacun se nourrit dans un verre de silice-polyimide / capillaire via un connecteur haute pression tolérant. Les capillaires sont de taille, puis inséré dans, endroits désirés spécifiés par la coutume, un conseil de fraisage positionnement stéréotaxique, permettant ainsi à des virus ou d'autres réactifs pour être livré à l'ensemble des régions du cerveau désirée. Pour utiliser l'appareil, le chirurgien remplit d'abord le sous-système fluidique entièrement avec de l'huile, des remblais des capillaires avec le virus, insère le dispositif dans le cerveau, et infuse lentement réactifs (<0,1 ul / min).
Cette technologie permettra à une grande variété de nouveaux types d'expériences, telles que milliseconde calendrier d'arrêt de façon complexe en forme de structures (telles que l'hippocampe) à des moments précis au cours de comportement, l'inactivation temporellement précise des structures bilatérales qui peuvent agir de manière redondante (tels que l'amygdale gauche et droite), et la perturbation de plusieurs régions cérébrales discrètes (par exemple, conduire deux régions reliées en opposition de phase pour étudier comment la Croix-région dépend de l'activité synchronie dans chaque région, ou de stimuler les entrées d'une région tout en taire un sous-ensemble de les cibles afin de comprendre lequel des plusieurs cibles sont essentielles pour la médiation des effets de ces entrées). Pour un grand cerveau comme celles chez le primate, dans lequel nous avons récemment démontré optiques de type cellulaire d'activation spécifique de neurones 3, perturbant l'activité dans une zone behaviorally pertinente peut exiger l'étiquetage virale de grandes structures complexes. Nous notons que les tableaux parallèles injecteur peut être utilisé pour injecter près de toute charge utile – les médicaments, les neuromodulateurs, des neurotransmetteurs, ou même des cellules – en 3-D complexes schémas dans le cerveau, d'une manière temporellement précis. Enfin, du point de vue de translation, il est possible que la rapidité, la thérapie génique patient personnalisés ou des dispositifs de délivrance de médicaments peuvent être rapidement personnalisés conçus et fabriqués pour correspondre à géométries cerveau individuel, en soutenant de nouveaux traitements pour une variété de pathologies, potentiellement grâce à l'utilisation des molécules de contrôle optique.
Les tableaux injecteurs sont conçus pour être précis, à la fois spatialement et volumétrique. Dans le X et Y-directions, ceci est accompli par le forage des trous placés de façon très précise en utilisant un moyen peu coûteux de mini-moulin, avec les trous juste assez grand pour accueillir les injecteurs, de sorte que les injecteurs sont tenues parallèlement les uns aux autres, et de manière précise emplacement. Dans la direction Z, les injecteurs sont coupés à l'aide d'un appareil de stéréotaxie, permettant un niveau de précision équivalente à celle de la chirurgie stéréotaxique lui-même. La précision volumétrique découle de la précision de la pompe à Hamilton, ainsi que les proches de zéro volume mort connecteurs, adapté de la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) sur le terrain. Les injecteurs sont fabriqués à partir de tube capillaire en silice fondue, ce qui est solide et assez rigide qu'il maintient la forme et un espacement précis sous pression, sans l'épaisseur plus grande muraille de solutions de rechange telles que des canules en acier. De petites modifications peuvent facilement être faits pour adapter le réseau parallèle injecteur à une variété d'expériences. Par exemple, si un plus petit volume de virus ou de l'espacement plus fine est nécessaire, les petits tubes capillaires peuvent être employés, avec un peu plus petit foret correspondant. Les futurs appareils peuvent utiliser des canaux microfluidiques et des pompes, pour augmenter le nombre d'injecteurs parallèlement, de minimiser la taille (peut-être permettant à ces dispositifs pour être montés sur la tête des animaux se déplacent librement).
The authors have nothing to disclose.
ESB admet un financement par le Prix du directeur des NIH Innovateur Nouvelle (DP2 OD002002-01), le NIH subvention défi 1RC1MH088182-01, le NIH Opportunités Grand-Grant 1RC2DE020919-01, le NIH 1R01NS067199-01, la NSF (0835878 et 0848804), le Programme McGovern Institute Award Neurotechnology , le ministère de la Défense, NARSAD, la Fondation Alfred P. Sloan, Jerry et Marge Burnett, le Prix de recherche SFN pour l'innovation en neuroscience, le MIT Media Lab, la Fondation Benesse, et le Wallace H. Coulter Foundation.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Company | 701N | Need one per injection site |
Mouse stereotax | Tool | Stoelting | 51725D | |
Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
0.011″ diameter drill bit for mini mill | Tool | Mcmaster-Carr | 8915A12 | |
1/32″ diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
Dental drill accessories | Tool | Pearson | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 |
|
1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small-Parts | HTX-15R | |
1-72 binding slotted machine screw | Material | Small-Parts | MX-0172B | |
1-72 hex nut | Material | Small-Parts | HNX-0172 | |
PCB proto-board, 1/32″ thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
Acrylic Sheet, 1/8″ thick | Material | Mcmaster-Carr | 8560K239 | |
HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR | 63018-827 |