Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

1. Costruire Morsetto Stereotassica Il morsetto stereotassica viene utilizzato per collegare l'array iniettore al stereotax, in modo che gli iniettori sono parallele al braccio stereotassica. Ogni laboratorio ha bisogno di un solo morsetto, a meno che non si prevede che più di un intervento chirurgico può avvenire contemporaneamente. In questo caso, fanno lo stesso numero il numero massimo previsto di interventi simultanei. Potrebbe anche essere consigliabile fare un ulteriore, in caso di danni al primo. Per rendere il morsetto stereotassica, in primo luogo, un diametro 1,5 mm esterno (OD) in acciaio cannula viene tagliata a 2 cm di lunghezza, e una delle estremità è Dremeled verso il basso fino piatto. Poi, un piccolo pezzo (circa 0,5 x 0,5 cm) è tagliato fuori PCB proto-board, da utilizzare come un distanziatore. Utilizzando un cutter laser per garantire che eventuali riduzioni effettuate sono perpendicolari alla superficie del materiale, due rettangoli uguali (1 / 2 "x 3 / 8") sono tagliati da 1 / 8 "fogli di acrilico, ogni rettangolo con due fori circolari in angoli opposti del rettangolo. La prima buca ha un diametro 1,5 mm, ed è solo abbastanza grande da contenere la cannula metallica ermeticamente. Il secondo foro ha diametro 1 / 16 "(Figura 1C). La cannula in metallo è inserito nel foro 1,5 mm di un rettangolo, poi attraverso il foro di 1,5 mm di secondo. L'estremità inferiore della cannula è allineato con la faccia inferiore del rettangolo in basso, formando la forma di un bastone da hockey. Pur mantenendo il distanziatore saldamente tenuto tra i due rettangoli, questa struttura è cementata insieme utilizzando colla a caldo intorno ai fori cannula e 1,5 mm, facendo attenzione ad evitare di incollare le distanziatore per i rettangoli. Plastilina può essere utile a tenere insieme le cose durante questo processo. Dopo che la colla si è asciugata, un 1-72 vite è inserito nel 1 / 16 buche dal lato superiore dei rettangoli. Poi un 1-72 dado esagonale che si avvita sulla fine della vite 1-72, e serrati. La vite e il dado servono a tenere insieme il morsetto. Per collegare il dado esagonale per la faccia inferiore del rettangolo in basso, piccole quantità di 5 minuti a resina epossidica sono sceso intorno al bordo del dado esagonale, senza permettere la resina epossidica per ottenere nei filetti del dado esagonale o vite. Qualsiasi plastilina viene rimosso e si conferma che il distanziatore può essere tenuto saldamente stringendo la vite. 2. Preparazione del sistema per l'array personalizzati iniettore: Hamilton pompa e stereotax Il sistema array iniettore può essere personalizzato per qualsiasi serie di coordinate nel cervello. Il primo utente individua le coordinate dei siti di iniezione desiderato in un mouse (o altre specie) atlante del cervello, la conversione in coordinate appropriato utilizzato dal stereotax (qui, X, Y e Z-coordinate). Il numero di siti di iniezione (tre in Figure 1A e 1B) sarà d'ora in poi essere chiamato k. k numero di siringhe da 10 microlitri Hamilton si trovano in una iniezione / prelievo pompa a siringa come questo da apparecchi di Harvard. Prossimo, 3-piede-lungo pezzi di tubo in polietilene sono saldamente collegato al l'ago della siringa ogni Hamilton. Per ogni pezzo di tubo in polietilene, un F-252 manicotto tubo dal Upchurch scientifico è scivolato sopra l'estremità aperta e collegata ad un P-627 adattatore di tubi utilizzando il dado inclusa e puntale, anche da Upchurch scientifico. 3. Costruire la matrice su misura Injector Ogni array iniettore è personalizzato per l'insieme di coordinate che l'utente sceglie. Tuttavia, per i set di coordinate che differiscono solo per uno / o di traduzione e di rotazione, l'array stesso iniettore può essere utilizzato. Considerando solo le coordinate X e Y relativo dei siti di iniezione, fori k sono perforati in un PCB proto-board di spessore 1 / 32 ", con la stessa spaziatura relativo. Questi fori sono realizzati utilizzando un mulino e un mini Modela 0,011" Diametro punta da trapano da McMaster-Carr. Assicurarsi di utilizzare una bassa velocità di foratura (Z-velocità) per evitare di rompere o usura la punta del trapano. Prima di rimuovere la scheda dal mulino, un rettangolo è forato intorno i piccoli fori, con una punta più grande del diametro 1 / 32 ", per evitare di indossare il più piccolo codice per il mulino mini possono essere generati facilmente utilizzando MATLAB;. Campione codice viene fornito nei seguenti file. generate.m – codice MATLAB per la generazione di codice Modela dalle coordinate desiderato holes_ex.rml – codice Modela per suoneria foratura (otto buche) in Proto-board outline_ex.rml – codice Modela per rettangolo intorno ai fori di trivellazione 245 micron OD/100 micron diametro interno (ID) tubi capillare di silice fusa, disponibile da Technologies Polymicro, è tagliato in numero k di 3 pezzi pollici. Questi comprendono gli iniettori singoli. Un pezzo di tubo capillare monouso è colpito conciascuno dei fori, per eliminare i detriti senza intasare gli iniettori reale. Gli iniettori sono poi inseriti a metà strada in ogni foro, in modo che si tengono strettamente e parallele l'una all'altra. Gli iniettori sono incollate alla tavola, che formano la struttura dell'array iniettore. Tutto ciò che rimane è quella di tagliare gli iniettori alla lunghezza corretta. L'array iniettore è collegato al morsetto stereotassica mettendo un angolo del proto-board tra i rettangoli acrilico, e poi stringendo la vite del morsetto stereotassica. Successivamente, la cannula metallica del morsetto è collegato al stereotax, utilizzando il meccanismo di fissaggio del stereotax. Tutti i seguenti è fatta sotto un microscopio. Per uno degli iniettori esterno (che è, uno che può essere affrontato dal lato con un regolo, senza sbattere contro nessuna delle altri iniettori), la punta si estende oltre la parte inferiore del proto-board è tagliato con le forbici. Per preparazioni iniettabili corticale, è opportuno avere l'iniettore una estensione di circa 5 millimetri al di là della superficie del proto-board. Per i più iniezioni, questo numero può essere aumentato dal corrispondente aumento in profondità. La punta è appiattito con un utensile Dremel. Suggerimenti iniettore può essere anche terra in un angolo come ulteriore precauzione contro l'intasamento, se la precisione in profondità è meno importante. Poi, un punto di riferimento stabile viene scelto all'interno del raggio del braccio stereotassica, e l'array iniettore viene spostato in modo che la punta appiattita del iniettore esterno, è a questo punto di riferimento. Un secondo iniettore è scelto, insieme con le sue coordinate corrispondenti. Considerato è la differenza relativa in altezza (direzione z) tra le coordinate primo e il secondo iniettore. L'array iniettore è spostato lungo l'asse Z da questa distanza relativa. L'iniettore secondo è tagliato e Dremeled alla lunghezza corretta, in modo che la punta di un iniettore secondo è ora piatta e all'altezza del punto di riferimento. L'array iniettore può essere spostato in direzione X e Y per facilitare il confronto della punta iniettore con il punto di riferimento. Questo processo di taglio viene ripetuto per gli iniettori rimanenti. 4. Assemblare l'intero sistema Il morsetto stereotassica e personalizzati serie iniettore, entrambi già costruiti, sono necessari per questa parte. Il back-end di ogni iniettore (alla fine che non è stato tagliato) viene inserito in un blu di F-240 manica tubi e, usando un dado P-235 e P-200 puntale da Upchurch scientifico, è collegato all'adattatore filettato già collegato alla pompa Hamilton da tubi in polietilene. Le istruzioni del produttore è consultabile per i dettagli. Usando una 27-gauge, olio di silicone viene iniettato nella parte posteriore delle siringhe Hamilton in modo che l'intero sistema viene riempito dalla siringa Hamilton alla punta iniettore, senza bolle d'aria a tutti. Come le siringhe Hamilton sono ri-collocati in pompa di Hamilton, il volume massimo possibile di olio di silicone viene mantenuta in siringhe. Se l'esperimento richiede più siringhe che la pompa è progettata per (due in questo caso), le siringhe possono essere distanziati con piccoli pezzi di plastica (per esempio, tappi ago) per tenerli paralleli l'uno all'altro, e per garantire che tutti i pezzi sono spinto dalla pompa nella stessa misura. O, un multi-rack kit di aggiornamento possono essere acquistati presso Apparato Harvard per contenere fino a 10 siringhe in una volta. 5. Iniezioni / chirurgia Il processo di iniezione con un parallelo iniettore è molto simile a quella di iniettare con una pipetta singola. E 'indispensabile l'utilizzo di ricarica lenta / tassi di infondere in tutto questo processo, perché veloce pompaggio potrebbero stressare la giunzione tra tubi grandi e piccoli. Consigliato rate massimo: 2 microlitri / min per il caricamento del virus, e 0,1 microlitri / min per infusione di virus. Un mouse anestetizzato si trova nel stereotax, e resta anestetizzato per tutto l'esperimento. Preparare il mouse, se necessario. Ad esempio, con un bisturi, un unico taglio è fatto lungo la linea mediana della pelle, da in mezzo agli occhi di tra le orecchie. La pelle è tirata indietro per esporre il cranio, e la fascia è rimosso. Una pipetta di vetro tirato è collegato al stereotax. Le posizioni delle barre dell'orecchio sono regolati fino bregma e lambda sono allineati alla stessa altezza, e in modo che la linea che li collega è parallela l'asse Y del stereotax. Gli assi del stereotax sono orientati secondo il sistema di coordinate in cui le coordinate di iniezione sono stati calcolati. Il stereotassica viene azzerato con la punta della pipetta di vetro a bregma, poi la punta è posizionata leggermente sopra il cranio al X e Y le coordinate di uno dei siti di iniezione. Utilizzando un trapano dentistico, il teschio sotto la punta è attentamente confrontato via fino a quando rimane uno strato estremamente sottile di tessuto osseo. La pipetta di vetro può essere inferioreed e cresciuto a verificare che il foro è perforato è centrato nella posizione corretta. Usando un 30-gauge, un piccolo pezzo di livello è leggermente raccolti al largo, al corretto X e Y-coordinate, in modo che la dura madre è esposta. Questo buco dovrebbe essere solo grande abbastanza da contenere una delle iniettori (0,25 mm di larghezza). Vedi Figura 1D per diagramma. In questo modo, i piccoli, fori 0,25 millimetri sono fatte largo nel cranio, al X e Y coordinate corrispondenti a ciascun sito di iniezione. La pipetta di vetro viene scartato in un apposito contenitore, e l'array personalizzati iniettore è collegato al stereotax utilizzando il morsetto stereotassica. Al fine di impostare correttamente l'angolo del vettore iniettore, due iniettori esterni sono scelti per essere calibrato a un punto di riferimento, come segue. Dopo uno degli iniettori è abbinato con il punto di riferimento, si consideri la relativa X e Y distanze tra i siti di iniezione iniettore rispetto a questo e altro. Gli assi del stereotax sono regolate in modo che tutta la serie iniettore viene spostata nel X e Y direzioni da questi distanze relative. Se l'iniettore seconda non è ora allineato con il punto di riferimento, la cannula metallica è allentato e ruotato. Questo processo viene ripetuto iterativamente fino a quando l'array iniettore è angolato in modo corretto. Prima di riempire gli iniettori con il virus, gli iniettori sono pieni di olio di silicone fino a quando le siringhe sono al punto 2 microlitri (o superiore). Ciò fornisce una zona cuscinetto, in modo che eventuali bolle d'aria o di intasamento nella punta può essere facilmente rimosso spingendo in avanti con l'olio della pompa di Hamilton, senza dover ricaricare l'intero sistema con olio di silicone dal retro delle siringhe, come descritto in precedenza. Un pezzo di Parafilm sterile è posto sul cranio, e gli iniettori sono leggermente abbassati sui Parafilm. Per le coordinate con profondità molto diverse, una custom-fresato parte (ad esempio un oggetto a forma di scala) potrebbe facilitare il caricamento. Le parti che seguono presuppongono che 1 ml di virus per essere caricato in ogni sito (le seguenti quantità dovrebbe essere ridimensionato se piccole quantità sono desiderati). Al fine di garantire che> 1 ml di virus viene iniettata in ogni sito, 1,5 ml di virus è pipettato sul Parafilm o scale in punta di ciascun iniettore. Con il tasso di riempimento della pompa Hamilton set a 1 microlitri / min, 1,2 ml di virus è riempito in ogni iniettore. La punta più lunga l'iniettore è azzerato al bregma, e poi l'array iniettore è spostata a X e Y coordinate di tale iniettore. Se l'intasamento è un problema, dire se molti obiettivi in ​​profondità sono coinvolti: anche prima di inserire i suggerimenti iniettore nel cervello, a volte è consigliabile iniziare l'infusione di pompa, fino a virus può essere visto emergere da tutte le iniettore punte. Ciò elimina le bolle d'aria alle estremità iniettore, e inoltre assicura che non c'è intasamento. Nel caso di intasamento, la pompa Hamilton è impostato per infondere un breve impulso ad una velocità superiore di 2 microlitri / min, per eliminare delicatamente intasamento. L'array iniettore è poi abbassato, attraverso i piccoli fori fatti con i 30-gauge aghi, per la corretta profondità Z. 1 ml di virus viene iniettato attraverso ogni iniettore, a 0,1 microlitri / min. Le iniezioni sono lasciati soli per 30 minuti. Dopo l'array iniettore sta lentamente estratte dal cervello, la pompa Hamilton è impostato per infondere allo stesso tasso di 0,1 microlitri / min, al fine di verificare la presenza di ostruzioni in ogni iniettore. Allora gli iniettori sono puliti da ricarica e infondendo 1,5 ml di etanolo a 2 microlitri / min. Infine, gli iniettori sono riempiti con olio di silicone per mantenere la zona 2 microlitri di buffer in ogni siringa Hamilton. Tutte le attrezzature devono essere sterilizzati prima e dopo la procedura, in base alla biosicurezza del vostro istituto e protocolli di utilizzo. 6. Rappresentante Risultati L'array parallelo iniettore accelera un intervento chirurgico o meno di un fattore pari al numero di iniettori, senza contare l'installazione e il tempo di recupero, anche se i tempi individuali dipenderà dalla capacità del praticante. Per una iniezione 1 microlitro, di solito visto l'espressione lentivirus in una sfera di diametro di circa 1 mm (Fig. 1E). La precisione dell'iniezione era tale che la variabilità nel posizionamento punta, da prova a prova, era di circa 45 micron (deviazione standard della distanza dalla posizione di punta nella posizione di punta previsto). Figura 1. Progettazione, implementazione e utilizzo di un array parallelo virus iniettore. A, schematica del parallelo sistema array iniettore, che mostra una configurazione tripla iniettore, per tre iniezioni simultanee. B, la fotografia di una triplice serie parallela iniettore come diagramma in A . <strong> C, morsetto stereotassica, mostrato a grandi linee dall'alto D, illustrazione della tecnica per una efficiente, riducendo al minimo i danni-, apertura di fori nel cranio per iniettore inserimento nel cervello:. con un trapano dentistico, il cranio sottile spessore fino a circa 50 micron, quindi utilizzare la punta di un ago affilato per aprire una piccola craniotomia. E, immagine che mostra fluorescenza channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-etichettata cellule in tre regioni corticali del mouse, come bersaglio l'array triplo iniettore mostrato in B.