Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

Nasıl davranış beyinde nöronal aktivite doğar anlamak için bu davranışı üretimi söz konusu sinir devreleri tanımlamak gereklidir. Küçük, şeffaf beyinleri geniş bir alanda hücresel çözünürlükte nöronal aktivite araştırmak olanak sağlar çünkü beyin fonksiyonu eğitim davranışı ile ilişkili larva aşamasında, zebra balığı ideal bir hayvan modeli sağlar. davranış¹gözlem sırasında beyin. Görüntüleme belirli nöronlar nöronal faaliyete GCaMP²gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum (Ca) göstergeleri (turk) icadı sayesinde mümkün olmuştur. GCaMP transgenik zebra balığı işlevsel sinir devre davranışı ile hayvanlar³davranışlar içinde Ca görüntüleme yaparak ilişkilendirmek için yararlı olması için kanıtlanmış.

CA görüntüleme nöronal aktivite ve davranışı arasındaki bağıntıları kanıtlamanın, nedensellik, göstermek için nöronal aktivite ve onun consequence(s) davranışı üzerinde test bastırılması iken önemli adımlar. Bunu sağlamanın çeşitli yolları vardır: belirli sinir devreleri⁴, nörotoksinler belirli nöronlar^5,6, halorhodopsin⁷gibi optogenetic araçların kullanımını ifade değiştirir genetik mutasyonun kullanın ve Lazer ablasyon hedeflenen nöronlar^8,9. Lazer ablasyon belirli nöronlar nispeten az sayıda etkinliğinde ortadan kaldırılması için özellikle uygundur. Geri dönüşü olmayan sinir hücreleri öldürmek tarafından nöronal aktivite kaldırılması davranış sonuçları değerlendirilmesi kolaylaştırır.

Zebra balığı larva safhasında gözlenen bir ilginç av yakalama (Şekil 1A) davranıştır. Bu görsel olarak destekli, hedefe yönelik davranış olumlu bir deneysel sistem görme keskinliği¹⁰, visuomotor dönüştürme^11,12,13, görsel algı ve tanınması için çalışma sağlar. nesneleri^{14,15,16,17,18}ve karar verme¹⁹. Nasıl yırtıcı yırtıcı ve AVI algılama av nasıl yol açar tarafından davranış yakalamak neuroethology²⁰merkezi bir soru olmuştur kabul edilmektedir. Bu yazıda, Pretetto çekirdeğinde projeksiyonları tarafından kurulan pretecto-hipotalamik devre rolü ele (çekirdek pretectalis superficialis pars magnocellularis, bundan sonra sadece Pretetto kaydetti) için ILH. Lazer-ablasyon Pretetto, av yakalama etkinliğini azaltmak ve nöronal visual av algı²¹ile ilişkili ILH etkinliğinde kaldırılması gösterilmiştir. Burada, yerine getirmek için kullanılan iletişim kuralları lazer ablasyon ve onun etkisi Ca^{2 +} görüntüleme ve davranış kayıt içinde zebra balığı larva açıklanmıştır kullanarak test.

1. bir Subpopulation bir lazer iki fotonlu mikroskop kullanarak nöronların ablasyon

Not: Kullanıcılar Ca görüntüleme aşağıdaki ablasyon edâ planlıyorsanız, UAShspzGCaMP6s satır²¹kullanın. Kullanıcılar davranış kayıt ablasyon takip edâ planlıyorsanız, ablasyon EGFP pozitif hücrelerinin daha GCaMP6s ifade hücrelerinin gerçekleştirmek kolay olan UAS:EGFP çizgi kullanın.

1. Etiketler belirlenmesi için belirli sinir hücreleri ve UAS:EGFP ya UAShspzGCaMP6s Gal4 bir satýr çiftleşme kadar ayarlayarak başlar. Sedef homozygotes elde edilebilir için her iki ebeveyn sedefli arka plan kullanmayı unutmayın.
   Not: Sedef homozygotes yok melanophores vücut yüzeyi (Şekil 1B) içerir. Mevcut çalışma, (ki Pretetto etiketleri) bir Gal4 satır gSAIzGFFM119B ve başka bir Gal4 hattı (hangi ILH etiketleri) hspGFFDMC76A kullanılan²¹vardır.
2. Ertesi gün çiftleşme kurulumu, zebra balığı yumurta toplamak ve onları bu noktada faiz nöronlar floresan gazetecilere ifade edecek larva aşaması için yükseltmek.
3. Zebra balığı larva de %2 düşük erime noktası-özel (Şekil 1B) bağlayın.
   1. %2 özel stok çözelti hazırlama başlayın: 2 g dağıtılması düşük erime noktası özel toz 100 mL sistem su (yani, dolaşımdaki su sisteminde yetişkin zebra balığı korumak için kullanılan su)²² veya E3 su²³, su getirerek Kaynama noktası bir mikrodalga ve şiddetle karıştırma için.
   2. Kaynar kadar % 2 düşük erime noktası özel hisse senedi mikrodalga. 6-cm Petri kabına kapağı üzerine özel 3.5-4.0 mL dökün. Böylece devam etmeden önce dokunmak sıcak özel soğur kadar bekleyin.
   3. Daha sonra (Bu adımda anestezi değil) tek bir larva özel yerleştirin. Böylece dik, diseksiyon iğne (Şekil 1C), konumu ve larva yönünü ayarlama tutmak larva uygun konumlandırma sağlamak için özel katılaşır kadar.
      Not: Larva iken özel katılaşır çevresinde yüzerek devam edecektir.
   4. Larva konumlandırılmış, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme.
   5. 5 mL tricaine çözeltisi (1 x çalışma konsantrasyonu % 0,4) özel dökün.
      Not: Hareketleri larva tarafından lazer Ablasyon sırasında önlemek için larvalar ablasyon işlemi imzalat tutulması gerekir.
4. Bir iki fotonlu lazer mikroskobu sisteminde beyazlatma işlevini kullanarak larva ablate.
   1. Bir iki fotonlu lazer tarama mikroskop altında özel katıştırılmış larva yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın.
   2. Görüntü alma yazılımı başlatmak ve lazer (Şekil 1D) açmak için "Lazer" sekmesinde "On" düğmesini tıklatın. "Modu-kilitli için." "Meşgul" değiştirmek için lazer "durum" bekleyin
   3. 880 lazer dalga boyu "Kanallar" sekmesinde ayarlanan nm (maksimum güç: Yaklaşık 2300 mW) EGFP ablasyon ya da 800 nm (maksimum güç: yaklaşık 2.600 mW) GCaMP ablasyon için.
   4. 20 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin. "Yerleştirme" sekmesini tıklatın, "GFP" optik yolları değiştirmek ve floresan göz tarafından doğrudan görüntülemek için.
   5. Zebra balığı larva beyin görüntüleme merkezinde bulun; sonra iki fotonlu mikroskobu geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın.
   6. 'Önce ablasyon' koşulu bir kayıt olarak, bir z-yığın görüntü 20 X objektif lens ile hızlı tarama-(ısı-zarar görmemesi için) hızda al. Daha sonra önce ve sonra ablasyon deneyler (Şekil 2A) çekilen görüntüleri karşılaştırın. "Z-yığın" z-yığın seçeneği seçin ve sonra larva beyin ventral tarafta odaklanarak alt sınırı (tıklayın "ayarla ilk" düğmesi") ve üst sınırı ("Son Set"düğmesini tıklatın) sekmesini genişletmek odaklanan sonra z fiş almak için tıklatın dorsal çoğu yüzey beyin. O zaman, z-yığın resim alma çalıştırmak için "Başlat Experiment" düğmesini tıklatın.
   7. 63 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin.
   8. Epi-floresan mikroskopi geçiş, görünümü merkezinde göz tarafından ablated için hücreleri bulun, sonra tarama mikroskobu lazer geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın için "Yerleştirme" sekmesini tıklatın.
5. "Satın alma modu" sekmesinde, "Çerçeve boyutu" 256 x 256 ayarlayın. "Canlı"'yı tıklatın ve nöronlar ilgi gözlemlemek.
6. En arka taraftan başlayarak, ablated için hücreleri odakta olan bir odak düzlemi bulmak.
7. Küçük, dairesel bir alan "Bölgeler" işlevini kullanarak yaklaşık üçte hücrenin boyutu çapı üzerinde her neuron ilgi (ROI) bir bölge olarak işaretleyin.
8. Bir lazer Işınma Zamanı yaklaşık 200 µs/piksel veya 200 µs/0,5 µm için karşılık gelen 13,93 s/256 x 256 piksel (134.42 µm x 134.42 µm), için tarama hızını ayarlar. Ayrıca, 4 tekrar ayarla (' yineleme döngüsü: 4'). Böylece yeterli ablasyon elde alternatif olarak, yineleme ve tarama hızı optimize edin.
9. Örnek (öncesi ve sonrası ablasyon) ve '(ROIs ayarlamak için) bölgeleri' veya eşdeğer işlevleri kullanılan yazılım (Şekil 1D) görüntüye ablasyon, 'saat serisi (2 döngüleri)' ile birlikte 'Bleaching' işlevi gerçekleştirir.
10. (Önce ablasyon) ilk görüntü ve zaman serisi ikinci resimde (sonra ablasyon) karşılaştırarak döngüsü, beyazlatma, floresan (Şekil 2B) arka plan düzeyinde gözlenen için hedeflenen hücreleri azalır, sonra emin.
11. Floresans ablasyon sonra hala varsa, yineleme sayısını artırmak.
12. Daha sonra odak düzlemi biraz daha derin (yani, ventral yan doğru) hareket ve nerede un ablated hücreleri görünür sonraki odak düzlemi seçin.
13. Ağartma işlevi (yukarıda adım 1.9) açıklandığı gibi yapar. İlgi sinirsel yapısındaki tüm hücreleri ablated kadar bu adımları yineleyin.
14. Ablated için sinirsel yapıları kapsayan tüm odak uçaklar gittikten sonra kaldırıldı floresan için hücreleri denetleyin. Bazı hücreler hala nedeniyle yetersiz ablasyon floresan olmak bulunursa, lazer-onları tekrar açıklandığı gibi ışınlatayım.
15. Larva özel lazer ile sonra kurtarılan gerekiyorsa, bu larva zarar verebilir çünkü dışında özel güç çalışmayın. Bunun yerine, dikkatle özel larva çevresinde küçük kesim dik onun vücut yüzeyine yapın. Daha sonra anestezik etkisi geçiyor zaman özel dışında kendi yüzmeyi larva için bekleyin.
16. Ablasyon için sonraki larva geçin veya denetim başka bir nüfus davranış soruşturma altında ilişki kurmadan nöronların kullanarak deneyler yapmak.
    Not: Burada, kontrol, UAS:EGFP nöronlarda olfaktör ampul olarak; gSAIzGFFM119B larva lazer ablated-(Şekil 2A, sağ) açıklanan aynı iletişim kuralını kullanarak.
17. Birkaç saat veya Ca görüntüleme (Bölüm 2) veya davranış kayıt (Bölüm 3) devam etmeden önce kurtarma için 1 gün izin. Bu kurtarma sırada, larva sağlık (yani, normal spontan yüzme, ablated alan, vbetrafında belirgin hiçbir ısı hasarı) denetleyin ve herhangi bir kötü sağlık belirtileri gösteren larva kaldırın.

2. kalsiyum görüntüleme Pretetto ablated zebra balığı larva av uyarılmış nöronal etkinliklerini kaydetmek için

1. Kayıt odası hazırlamak için güvenli-mühür hibridizasyon odası conta yapıştırıcı yüzü cama bakacak şekilde bir cam slayt üzerinde koymak ve en iyi mühür kaldırın.
   Not: Bu 9 mm jant çapında ve derinlik (Şekil 3A) 0.8 mm bir küçük kayıt odası oluşturur.
2. Daha sonra bir naylon mesh yerleştirin (açılış boyutu: 32 µm) kesip alt var bir 50 mL tüp üzerinde. Kap kafes Tube (Şekil 3B) bağlamak için kullanın.
3. Paramecia (av larva için görsel uyarıcı kullanılacak olan) hazırlayın.
   Not: Terliksi Hayvan Kültür (adım 2.3.1 ve 2.3.2) hazırlamak önceden.
   1. Paramecia tohum kültür ticari kaynakları veya akademik biyo-kaynak merkezleri²⁴ önceden alabilirsiniz.
   2. Kültür autoclaved pirinç saman ve Pelet kuru bira mayası²² (Şekil 3C) içeren suda birkaç gün Terliksi Hayvan .
   3. Terliksi Hayvan kültür 2 elekler gittikçe dökün (150 µm diyafram ile bir başka bir 75 µm diyafram ile tarafından takip) enkaz kültür kaldırmak için.
   4. Paramecia akışı aracılığıyla önceki adımda bir naylon mesh (13-µm diyafram) toplamak.
   5. Paramecia bir sıkmak şişe sistemi su (Şekil 3D) kullanarak bir cam kabı içine naylon mesh üzerinde yeniden askıya alma.
4. Kafes (Şekil 3B) (Şekil 3E) x 2 sistem suda yıkayın.
   Not: Bu adımın amacı da çalışmanın amacı gözlemlemek için görsel olarak nöronal aktivite tahrik olduğu gibi herhangi bir olası odorants ve Terliksi Hayvan kültür ortamı, içerdiği tastants kaldırmaktır.
5. Zebra balığı larva tricaine çözüm anestezi için yerleştirin.
6. Tek bir larva iken % 2 düşük erime noktası özel olarak bağlayın.
   1. İlk olarak, % 2 düşük erime noktası özel mikrodalga ve 1/10 birim konsantre tricaine x 10 için özel ekleme.
   2. Tricaine içeren özel bir damla kayıt odası (Şekil 3A) yerleştirin.
   3. Onayladıktan sonra özel çok sıcak değil, (Kimden adım 2.5) imzalat larva özel yüzeyi hafif bombeli görünüyor ki hemen aşırı herhangi bir özel kaldırma özel yerleştirin.
   4. Hızlı bir şekilde larva dik bir diseksiyon iğnesi (Şekil 1C) gelecek şekilde yönlendirin.
      Not: Bu yordamları özel katılaşır önce birkaç saniye içinde tamamlanmalıdır.
   5. Larva şekilde alacak biçimde yerleştirildiğinden, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme. Sonra bir damla 1 x tricaine çözüm özel dökün.
7. Zebra balığı larva başının etrafında özel kaldırmak ve cerrahi bir bıçak kullanarak yüzmeyi Terliksi Hayvan için yer açın. Bunu yapmak için ilk olarak, özel (Şekil 3F) içinde bir kaç küçük kesim yapmak. Sonra yavaşça odası üzerinde sistem su dökerek aşırı özel dikkatli bir şekilde çıkarın.
   Not: Bu adımda, tricaine yıkanması.
8. Daha sonra bir amip görsel bir uyarıcı hizmet için kayıt odasında koymak.
   Not: Terliksi Hayvan zebra balığı larva Başkanı yüzer zaman nöronal yanıt (Şekil 3G) uyandırmak.
9. Kayıt odası bir epi-floresan mikroskop altında bir bilimsel CMOS Kamera (Şekil 3H) ile donatılmış ve bir 2.5 X objektif lens (Şekil 3ben) seçin.
10. GCaMP floresan sinyallerini hızlandırılmış kayıtları toplamak.
    1. Donanımlı kamera görüntü satın alma uygulamasını başlatın.
    2. "Sıra bölmesi" ve "Sabit Disk kaydı" üstünde belgili tanımlık cam seçin. Tarama ayarları bölümünde, "çerçeve istenen sayısı" 900 ya da herhangi bir diğer toplam çerçeve numarasına ayarlayın.
       Not: Varsa, bir modül ile hızlandırılmış kayıt yazılımı kullanır (burada, "Sabit Disk kayıt") sağlayan bir sabit disk üzerine veri verimli kaydetme.
    3. "Yakalama" Bölmesi'nde, pozlama süresi 2 x 30-ms (yani, 33,3 fps) ve Binning 2 olarak ayarlamak.
    4. GCaMP benzer uyarma/emisyon spectra GFP için olduğu gibi dokunmatik panel kontrol mikroskobunun GFP için ayarla bir filtre seçin.
    5. "Live" içinde belgili tanımlık fotoğraf makinesi görünümünü ve odak (Şekil 4A), larva bulun ve sonra "Live durdurmak"'ı tıklatın ve "Başlat" düğmesine tıklayın için yakalama Bölmesi'ni tıklatın. Film .cxd veya satın alma durumu ile ilgili bilgiler başka bir biçimde kaydedin.
11. Sonra kayıtları, hızlandırılmış film Fiji²⁵özgür yazılım kullanarak beyin yapısında ayarlayın yatırım getirisi için Ortalama piksel değerlerini elde ederek GCaMP6s floresan sinyallerini (Ca sinyalleri) analiz.
    Not: Fiji olduğunu birçok yararlı tapa-içinde ile a yorum-in ImageJ'ın önceden yüklenmiş ve .cxd biçimi görüntü dosyaları ile Bio-oluşum-ebilmek okumak eklentisi.
12. Larva biraz kayıt sırasında taşırsanız, Fiji'de TurboReg eklenti²⁶ çalıştırarak görüntü kaydı gerçekleştirmek. Menüden, 'Eklentiler', 'Kayıt' ve 'TurboReg' seçin.
13. Nasıl çalışma amacı göre verileri çözümlemek için göz önünde bulundurun. Bir örnek aşağıdadır.
    1. F/F0 (floresan yoğunluğu tarafından floresan yoğunluğu istirahat veya herhangi bir Ca geçici gerçekleştirilmeden önce bölünmüş her zaman) aşağıdaki gibi hesaplar:
    2. Ayarla ROIs Pretetto veya ROI Yöneticisi'ni kullanarak ILH: menüde, "Analiz"Araçlar,""ROI Yöneticisi"," seçin ve "Ekle" (Şekil 4A) ROIs listesinde.
    3. ROIs için Ortalama piksel değerlerini hesaplamak (i.e., floresans yoğunluklarını GCaMP6s in) ROI Yöneticisi panelde seçerek: "Daha fazla," "Çok ölçü" ve "Tamam." Sonuçları bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
    4. Sinyalleri gürültülü olarak, sinyalleri 11 saat-elektronik tablo verilerini işleyen bir Web uygulaması kullanarak puan (hareketli ortalama) için Ortalama.
    5. F (zamanla yoğunluklarda floresan) F0 tarafından bölmek (floresan yoğunluğu bazal düzeyinde) normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplamak için. Veri görselleştirme, örneği değiştikçe normalleştirilmiş GCaMP6s floresan yoğunluğu Pretetto ve ILH renk kodlu ve Terliksi Hayvan yörüngeler (Şekil 4B - D) eşleştirilmiş.

3. lazer ablasyon aşağıdaki davranış sonuçları değerlendirilmesi

1. Bir video kamera ile donatılmış bir stereoscope oluşan bir davranış kayıt sistemi ayarlayın. Bir fotoğraf makinesi bir uygun görüntü alma yazılımı ile ticari veya özel yapım (Şekil 5A) kullanın.
2. Aydınlatma koşulu Terliksi Hayvan görüntü işleme tarafından tespit edilebilir en iyi duruma. Örneğin, bir yüzük beyaz LED ışık bir ile (Şekil 5B) kullanılmalıdır.
   Not: Mesafe ve açısını, LED örnek (yani, karanlık arka planda parlak veya parlak arka planda karanlık) ve vardır, bu nedenle, başarılı görüntü işleme için kritik görünümünü etkiler. Rondela (Şekil 5C) en iyi yüksekliğini belirler.
3. (Bölüm 1'de açıklanan lazer ablasyon deneme kurtarılan) bir zebra balığı larva (hangi bir cam slayt için bağlı olduğu) bir davranış kayıt odası kaldırıldı orijinal en iyi mühür ile (Şekil 5D) yerleştirin.
4. 50 paramecia Kültür (adım 2.3.5) toplamak bir micropipette kullanarak ve kayıt odasına koyun.
5. Bir kapak notu kayıt odası üstüne yerleştirin. Küçük bir damla su ile ilgili kapak formu hava odasında tanıtımı önlemek için kayıt odası su yüzeyinde yerleştirmeden önce koymak.
   Not: Bu adımda, biraz su paramecia ile kayıt odasından taşma. Paramecia kayıt odasında kalan sayısı yaklaşık 30-40 olacak.
6. (Bir larva ve parameciaiçeren) kayıt odası aydınlatma sistemi (Şekil 5D) yerleştirin.
7. 11 dk (6600 çerçeveler) için 10 kare/sn, hızlandırılmış kaydını Başlat seçimini yapın.
8. (İsteğe bağlı) Davranış için test edildi her larva için lazer ablasyon (yani, devamsızlık veya önemli ölçüde azaltılmış sayısı, floresan hücreleri etkinliğini doğrulamak için floresan mikroskopi tarafından lazer ablated alanlarda floresans gözlemlemek Lazer ışınlanmış alan).
   Not: Işınlama sonra bile, floresan bazı hücreler hala daha sonra Gal4 gen ekspresyonu ablasyon²⁷sonra Ayrıştırılan hücrelerdeki başlangıçlı nedeniyle görülebilmektedir.
9. Larva'nın davranışı, tekdüzelik arka planda eksikliği telafi etmek için kaydettikten sonra her kare piksel piksel bölünmesi Fiji ortalama bir görüntü yerine getirilir: 'Süreç 'Görüntü hesap makinesi',' tıklayın ' işlemi: bölmek ', ' 32-bit (float) sonuç ', ve ' Tamam '. Ortalama bir resim yapmak, 'Resim', 'Yığar', 'Z-projesi', 'Ortalama yoğunluğu' ve 'OK' (Şekil 5E, F)'ı tıklatın.
10. Paramecia sayısı 'Analiz 'Parçacıklar analiz',' ı tıklatarak odasında yaptı sayısı tüm paramecia, kapsayan bir alan aralığı ayarını 'Gösteri: maskeler' onay kutusunu kontrol ve 'Tamam' tıklatın. 'Show: maskeler' seçeneği ayıklanan paramecia görüntüyle (Şekil 5G), parçacıklar (paramecia) her kare sayısı listesini sağlar.
11. Paramecia sol kayıt odasında sayısı zaman içinde arsa. Paramecia sayısı tahminleri gürültülü olduğu için hareketli ortalama 600 kare (1 dk) elektronik tablo bir aralıktaki her noktasında yapmak tavsiye.

Belirli nöronlar genetik olarak EGFP ya da GCaMP6s Ifade Gal4 satırlarında tahrik, etiketlenmiş. Gal4 hattı gSAIzGFFM119B bir çekirdek pretectal alanında (magnocellular yüzeysel pretectal çekirdeği), hem de bir subpopulation olfaktör ampul nöronların etiketlemek için kullanıldı. Başka bir Gal4 satır, hspGFFDMC76A, ILH etiketlemek için kullanıldı. Biz lazer-pretectal nöronlar bilateral ablated (resim 2A sol paneli) ve aynı zamanda nöronların olfaktör ampul çift taraflı bir denetim (Şekil 2A doğru kapı aynası) bir Gal4 satır gSAIzGFFM119B zebra balığı larva olarak ablated bu UAS:EGFP muhabir balıkla şeklindeki. Sonuçlar iki fotonlu lazer hedefli hücreler bitişik hücreleri veya neurites etkilenmez (Şekil 2B) bırakarak ablate gösterir.

Pretectal nöronlar ipsilaterally onların aksonlar ILH doğru proje. Burada, biz Ca Imaging'i kullanma onların fonksiyonel bağlantı araştırdık. Bu bölgedeki nöronal aktivite Ifade Gal4 satır gSAIzGFFM119B tarafından tahrik Ca sinyalleri bir Ca sonda GCaMP6s ile (Şekil 4A), olarak görülmektedir (Şekil 4B) veya başka bir Gal4 satır hspGFFDMC76A (Şekil 4 C). renkli ok uçları (Şekil 4) Yüzme yön ve renk kodlu Ca sinyal-değişiklikler yanı sıra Terliksi Hayvanyörüngeleri belirtilen beyin alanında, yüzme görerek uyarılmış show Terliksi Hayvan (Şekil 4B-D). Hem Pretetto (Şekil 4B) ve her iki nöron faaliyetleri görsel olarak tahrik düşündüren bir av, proksimal varlığını gösterdi ILH (Şekil 4C) nöronal faaliyette.

Çift Kişilik Gal4 GCaMP6s larva (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; kullanarak UAShspzGCaMP6s), Pretetto nöronal aktivite ve ablated larvalar ILH gözlemlemek için görüntüleme pretectal nöronlar tek taraflı olarak ve daha da gerçekleştirilen Ca ablated. Lazer ablated sol Pretetto bu lazer ablasyon başarılı olduğunu mu ima nöronal aktivite için (Şekil 4D, sol üst), kalan gösterdi. Ancak, Ipsilateral ILH önemli ölçüde azaltılmış nöronal aktivite (Şekil 4D sol alt), ILH ana girişine Ipsilateral Pretetto geldiğini düşündüren gösterdi. Buna ek olarak, lazer ablated Pretetto (Şekil 4D sağ altta) diğer tarafında ILH gösterdi nöronal aktivite nöronal aktivite karşılaştırılabilir Ipsilateral Pretetto (Şekil 4D, sağ üst), hangi doğru ILH doğru Pretetto girişleri aldığını gösteriyor.

Seçtiğiniz bir deneyde kullanılacak davranışsal hangi tahlil bir soruşturma altında nöronların olası rolleri bağlıdır. İşte, bir örnek bir av dedektörü²¹tespit edildi pretectal bir çekirdeğin ablasyon takip bir av yakalama testin göstermektedir. Şekil 5A-Diçinde gösterilen aydınlatma sistemi kullanarak, kayıt odasında Terliksi Hayvan sayısı tarafından görüntü işleme (Şekil 5E-G) sayılabilir. Gözleri çıkarımı otomatik ve ayrıca zebra balığı larva gözünde bu aydınlatma durum (Şekil 5H arka planda daha koyu görünür için göz pozisyonları (yani, gözleri açılarını değişimler) hesaplanması mümkün olabilir ).

Deney sonuçlarını göstermek bu ikili pretectum kaldırıldı av yakalama etkinliği (Res. 5I, PT) ablasyon olfaktör ampul nöronlarda bir subpopulation ablasyon yaparken değil (Şekil 5ben OB). Bu sonuçları Şekil 4' te gösterilen deneyler ile birlikte pretecto-hipotalamik devre av yakalama davranışlara gerekli olduğunu göstermektedir.

Resim 1 . Zebra balığı larvaları. (A)5 - gün eski (5 günlük sonrası döllenme (5-dpf)) zebra balığı larva ve avını bir amip. (B) 4-dpf sedefli larva % 2 düşük erime noktası özel içinde gömülü. Retina pigment epiteli bozulmamış ise sedef zorlanma vücut üzerinde siyah pigmentler yoksun olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu: Dissecting zebra balığı larva özel olarak yönlendirme için kullanılan 0.5 mm. (C) iğne. Ölçek çubuğu: 1 cm. (D) Screenshot-in belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanılan iki fotonlu mikroskobu kullanıldı "Bleaching", "Zaman serisi" ve "Bölgeler" panelleri ablasyon gösteriliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Bir subpopulation iki fotonlu lazer mikroskop kullanarak nöronların ablasyon. (A) 4-dpf zebra balığı larvalar önce ve sonra ablasyon nöronların EGFP floresan görüntüleri. Üstten görünüm ve görüntü işleme yazılımı kullanarak 3B yeniden oluşturulan z-yığın görüntüleri yan görünüm. Z-yığın görüntüleri bir 20 X objektif lens ile alındı. Ablated alanları (Pretetto veya olfaktör ampul) sarı daire içine alınmış. Ölçek çubuğu: 100 µm. ()B) lazer ablasyon "Bleaching" işlevini kullanarak tek bir odak düzlemi, örneği. Lazer ışınlanmış alanları (ROIs ayarla) her hücre üzerinde renklerde gösterilir. Ölçek çubuğu: 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Şekil 3 . Zebra balığı larva ve paramecia hazırlık için Ca düşsel. (A)kayıt odası. Piyasada bulunan 9 mm çap x 0.8 mm derinlik hibridizasyon conta 8 chambers ile kayıt odası kullanılmıştır. Conta bir cam slayt üzerinde koymak ve yapıştırılır. Mühür üst kısmında conta soyulmuş. ()B) parameciadurulama için kullanılan naylon mesh (32 µm). Mesh bir 50 mL tüp yerleştirildi. (C) Terliksi Hayvan içeren pirinç saman kültür ve Maya granül Makinası. (D) Terliksi Hayvan hisse senedi çözüm C. (E) Terliksi Hayvan hisse senedi çözümde gösterilen kültür hazırlanan iki kez ortamda mümkün koku ve tat ipuçları kaldırmak için sistem su ile durulanır. (F) Terliksi Hayvan kayıt odasında gömülü. Özel bir bölümünü kaldırmak için birkaç kesim yapıldı. (G) kayıt odası bir zebra balığı larva ve bir amipile. Özel çoğunluğu yüzmeyi Terliksi Hayvan izin vermek için kaldırıldı. Zebra balığı larva Başkanı maruz kalmaktadır. CA görüntülemede kullanılan (H) dik floresan mikroskop. Mikroskop bilimsel bir CMOS fotoğraf makinesi ile donatılmıştır. (ben) zebra balığı larva uyarma ışık ile mikroskop altında kayıt odasında. 2.5 X objektif lens ile ışıklı alan biraz odası boyutundan daha büyüktür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 . Temsilcisi veri görüntüleme Ca. (A)Pretetto ve sarı, bir çift Gal4 hspGFFDMC76A daire içine alt lob (ILH), hipotalamus, konumunu; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s zebra balığı larva. (B) değişiklikler renk eşlenmiş bir gSAIzGFFM119B içinde bir amip yörüngeleri üzerine (bilateral Ortalama) pretectum Ca sinyal içinde; UAShspzGCaMP6s larva. Ölçek çubuğu: 1 mm. (C) bir hspGFFDMC76A; ın Terliksi Hayvan yörüngeleri üzerinde renk eşlemesi (bilateral Ortalama) ILH Ca sinyal, değişimler UAShspzGCaMP6s larva. Ölçek çubuğu: 1 mm. (D) Pretetto ve ILH Ca sinyalleri renk eşlemeli bir Terliksi Hayvan hspGFFDMC76A; ın yörüngeleri üzerinde değişiklikler gSAIzGFFM119B; İki fotonlu lazer-ablasyon için sol Pretetto, maruz kaldığı UAShspzGCaMP6s larva. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu görüntü aynı çoğaltılamaz veri daha önce²¹yayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 . Av yakalama tahlil ve temsilcisi lazer ablated zebra balığı larva verilerde. (A)davranış kayıt sistemi. Stereomicroscope bir CMOS Kamera ile donatılmıştı. Görüntüleri özel bir komut dosyası kullanarak elde. (B) aydınlatma sisteminin bileşenleri. Gri renkli kağıt, cam difüzör, beyaz LED ring ışık, difüzör, bir ısmarlama rondela (karton) ve merkezi bir delikle difüzör. (C), b (D) kayıt odası av yakalama tahlil için gösterilen yerlerinden aydınlatma sistemi monte. Bir oda (çapı: 20 mm; Derinlik: 2.5 mm) bir cam slayt üzerinde yerleştirildi. Orijinal en iyi mühür odasının soyulmuş. Cam kapak üzerinde kayıt odası konulmuştur. (E) kaydedilen film karesinden Raw görüntü. (F) A çerçeve (piksel x piksel) bir film ortalama bir görüntüde bölünür. Not üniform olmayan arka planda aydınlatma bu görüntü işleme tarafından telafi edilebilir. (G) Paramecia Fiji'de "Parçacık analiz" işlevini kullanarak bir kare elde. Fiji görüntüde uygulanan bir eşik değeri ile (H) örneği. Oysa zebra balığı larva gözleri karanlık görünür ve arka planı gri paramecia parlak, görünür. Gerekirse değişiklikleri göz pozisyonlarda (yani, açılar ile ilgili vücut eksen) hesaplanabilir. (ben) bir koku ampul ablated denetim larva (OB) ve bir Pretetto ablated larva (PT) Terliksi Hayvan tüketiminin temsilcisi deneysel veriler. Olfaktör ampul ablasyon etkilemedi iken pretectum ablasyon av avcılık yeteneği önemli ölçüde azaltılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

İki fotonlu lazer özellikle bireysel nöronlar ablate için mükemmel bir uzaysal çözünürlük olmasına rağmen ısı nedeniyle beyin dokusu üzerinde istenmeyen herhangi bir zarar vermemek için çok dikkatli alınmalıdır. Ablasyon deney konusunda en önemli adım lazer ile en uygun miktarda tespit etmektir. Yetersiz ışınlama nöronlar öldürmek başarısız olur. Çok fazla ışınlama istenmeyen etkileri neden olur çevreleyen doku ısı-hasar olacak. Lazer ile (ROIs, yinelemeler ve tarama hızı alanları) optimum aralığı dar gibi görünüyor. Birkaç etken ablasyon verimliliğini etkiler.

İlk olarak, farklı floresan muhabir proteinler kullanarak, ablasyon koşulları her muhabir için optimize edilmiş olması gerekir. GCaMP ifade çekirdeği yoksun sitoplazmada görülmektedir. Buna ek olarak, EGFP floresan, verimli ve belirli ablasyon GCaMP için karşılaştırıldığında hedeflenen hücrelerin için avantajlı olabilir hücresi boyunca görünür. Bir lazer ablated GCaMP ifade hücre EGFP ablasyon için kullanıldığında azalmış floresan yoğunluğu aksine hemen büyük Ca akını nedeniyle artan floresan yoğunluğu sergilemek gibi GCaMP de dezavantajlı kullanmaktır. Böylece, floresan değişimi ablasyon ile GCaMP ölçüde güvenilir bir göstergesi olamaz. Bu gibi durumlarda, belirli bir süre sonra floresan hücrelerinin kaybı gözlemleyerek ablasyon doğrulamak gerekli olabilir. Devamsızlık veya Ca sinyalleri ablated alanında önemli azalma GCaMP ile başarılı ablasyon için başka bir ölçüt olabilir.

İkinci olarak, (yani, tarama hızı, tarama yineleme sayısı) miktarı lazer ışınlama başarılı ablasyon için gerekli beyin yüzeyine neurons konumunu derinliği bağlı olarak değişebilir. Yüzeye bulunan hücreleri ile karşılaştırıldığında, bu derin beynin içinde bulunan onları ablate daha zorlaştırır daha fazla lazer ile böylece, gerektirir. En iyi duruma getirme miktarı için lazer ile özellikle nöronlar hedeflenen her subpopulation için tespit edilmelidir.

Üçüncü olarak, bu ampirik olarak o bir sayısını ROIs bir inceden inceye gözden geçirmek içinde küçük bir alanda kez ısı zarar görmüş hücreleri de etrafında doku ayarlama gözlenmiştir (lazer ışınlanmış alan kabarcıkları görünümünü tarafından karar), tek başına veya seyrek bir hücre hedefleme ise bir tarama aynı koşul altında dağıtılmış ROIs zararlı etkileri yoktu. Bu da çalışmanın, beyazlatma bir küçük bölge (yaklaşık üçte biri hücre vücut büyüklüğü) hedef hücreleri dışında dokulara zarar görmemesi için uygulandı. Genellikle 5-10 hücreler her odak düzlemi (4-8 uçak tüm pretectal alanı kapsayacak şekilde) hedef.

Lazer ile miktarı optimize yanı sıra, geniş doğrulama denetimi deneyler yaparak lazer ablasyon önemlidir. Bir denetim deney okudu davranış dahil olmak olası değildir hücre başka bir subpopulation lazer ablasyon içerebilir. Aynı Gal4 satırında etiketli olfaktör ampul nöronlar kontrol mevcut çalışmada (Şekil 2A, doğru ve Şekil 5ben) olarak görev yaptı. Ancak, yukarıda açıklanan nedenle, nöronların grup yok ideal bir denetimi olarak hizmet verebilir. Her subpopulation nöron beyin, hücre yoğunluğu, floresan muhabir transgene ifade düzeyinde, yayılma hızı ve zamanlama muhabir transgene ifade içindeki konumlarını ilgili olarak diğerlerinden farklıdır. Bu farklılıklar ablasyon ('Bleaching' işlevi) denetim deneylerde için tam olarak aynı ayarı kullanmak imkansız hale. Böylece, farklı türde denetim deneyler de, optokinetic yanıt, görsel davranışı²⁸ve hareket²¹ bazal faaliyet ölçümleri gibi ablasyon belirli etkisi emin olmak için dikkate alınmalıdır.

Deneyim, ablasyon pretectal hücreleri, onlarca çift taraflı, (özel, özel ablasyon sonra almak için bir iki fotonlu mikroskop kullanarak ablasyon katıştırma) üzerinden yaklaşık 1 saat sürer. Günde 8 larva (Örneğin, deneysel ve 4 4 larva denetimi için) ablated; Bu nedenle, birkaç deney setleri yeterli larva bir deney grubu için emin olmak için gerekli (Örneğin, n = 12) ve kontrol grubu için (Örneğin, n = 12). Ayrıca, bu yarım bir gün veya larva ablasyon (Örneğin, lazer ablasyon, 4-dpf davranış kayıt 5-dpf veya ablasyon Ca görüntüleme öğleden sonra ardından sabah takip) kurtarmak için bir gün izin için arzu edilir. Bu kurtarma süre boyunca, herhangi bir kötü görünümlü larva çalışma dışlanmaları gerekir.

Elde edilen verileri analiz etmek için kullanılan iletişim kuralı tamamen çalışma amacı bağlıdır. Bu da çalışmanın Terliksi Hayvan görme alanı içinde konumunu ve nöronal aktivite Pretetto ve ILH arasındaki ilişkileri üzerinde duruldu. Yavaş çürüme dikkate alınarak (~ saniye) GCaMP6s sinyalleri²⁹uncu, artış, ama azalma değil, sadece zamanlaması GCaMP6s sinyalleri ilişkili olan Terliksi Hayvankonumu ile. Terliksi Hayvan taşısanız uzak Ca sinyalleri yüksek olabilir. Dolayısıyla, yalnızca veri sunumunu GCaMP6s yoğunluğu artan floresans dahil. Bu tür bir analizi genellikle belirli programlama dili veya makro dilleri ile yazılmış özel komut dosyalarını gerektirir. Bu yazıda kullanılan komut dosyaları talep üzerine temin edilmektedir.

Ölçülü koşulu (yani, özel katıştırılmış) bir dereceye kadar zebra balığı larva için stresli olabilir; Ancak, biz stres kaynaklı belirgin nöronal aktivite veya davranış bu durumda free-swimming koşul^21,22ile karşılaştırıldığında gözlemleme. Zebra balığı özel katıştırılmış larva en az 24 saat, (muhtemelen daha fazla) belirgin herhangi bir sorun olmadan hayatta kalamaz. Terliksi Hayvan-tahrik Ca sinyalleri Pretetto ve ILH kısıtlanmış durumda free-swimming larva²¹' gözlemlenen benzer. Zebra balığı görsel davranışı sirkadiyen ritim tarafından kontrol edilebilir. Bu nedenle, biz geç için erken akşam davranış deneyler yaptı. Vahşi türü ve kontrol larvaları çok sayıda paramecia bu kayıt süresi sırasında tüketilen.

Burada açıklanan işlevsel ve davranışsal deneyleri birçok laboratuvarlarda bulunabilir veya kolayca kurmak olabilir en yaygın olarak bulunan ekipman kullanmak ve böylece farklı davranış bilimleri alanlarında geniş uygulamalar olmalıdır.