Ablation af Neuronal indbyggere ved hjælp af en to-foton Laser og dets vurdering ved hjælp af Calcium Imaging og adfærdsmæssige optagelse i zebrafisk larver
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at ablate en genetisk mærket delpopulation af neuroner ved hjælp af en to-foton laser fra zebrafisk larver.
Abstract
For at identificere rollen, en delpopulation af neuroner i adfærd, er det vigtigt at teste konsekvenser for at blokere sin aktivitet i levende dyr. Laser ablation af neuroner er en effektiv metode til dette formål, når neuroner er selektivt mærket med fluorescerende sonder. I den foreliggende undersøgelse, er protokoller for laser ablating en delpopulation af neuroner ved hjælp af en to-foton mikroskop og afprøvning af dets funktionelle og adfærdsmæssige konsekvenser beskrevet. I denne undersøgelse bruges bytte fange adfærd i zebrafisk larver som undersøgelse model. Pretecto-hypothalamus kredsløbet er kendt for at ligge til grund for denne visuelt drevet bytte fange adfærd. Zebrafisk pretectum var laser-ablated, og neuronal aktivitet i den ringere lap af hypothalamus (ILH, målet for den pretectal projektion) blev undersøgt. Bytte fange adfærd efter pretectal ablation blev også testet.
Introduction
For at forstå hvordan adfærd udspringer af neuronal aktivitet i hjernen, er det nødvendigt at identificere de neurale kredsløb, der er involveret i generation af denne adfærd. På stadiet larve i zebrafisk giver en ideel dyremodel for at studere hjernefunktion er forbundet med adfærd fordi deres lille, gennemsigtig hjerner gør det muligt at undersøge neuronal aktivitet på et cellulært opløsning i et bredt område af den hjernen mens observere adfærd1. Billeddannelse af neuronal aktivitet i specifikke neuroner er blevet mulig gennem opfindelsen af genetisk kodet calcium (Ca) indikatorer (GECIs) som GCaMP2. GCaMP transgene zebrafisk har vist sig for at være nyttige for knytte den funktionelle neurale kredsløb med adfærd ved at foretage Ca imaging i opfører dyr3.
Mens Ca imaging kan påvise sammenhænge mellem neuronal aktivitet og adfærd, for at vise kausalitet, undertrykkelse af neuronal aktivitet og teste sin consequence(s) på adfærd er vigtige skridt. Der er forskellige måder at opnå dette: brug af genetiske mutation, der ændrer specifikke neurale kredsløb4, udtryk for nervegifte i specifikke neuroner5,6, brug af optogenetic værktøjer som halorhodopsin7, og laser ablation af målrettede neuroner8,9. Laser ablation er især velegnet til at fjerne aktivitet i et relativt lille antal specifikke neuroner. Irreversibel eliminering af neuronal aktivitet ved at dræbe neuroner letter vurdering af adfærdsmæssige konsekvenser.
En interessant adfærd, som kan observeres på stadiet larve i zebrafisk er bytte capture (fig. 1A). Denne visuelt styret, målrettet adfærd giver en gunstig eksperimentel system for studiet af synsskarphed10, visuomotor transformation11,12,13, visuel perception og anerkendelse af objekter14,15,16,17,18, og beslutningstagning19. Hvordan bytte er anerkendt af rovdyr og hvordan bytte opdagelse fører til bytte fange adfærd har været et centralt spørgsmål i Neuroetologi20. I dette papir, vi fokusere på rollen som den pretecto-hypothalamus kredsløb dannet ved projektioner af en kerne i pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, herefter blot noteret som pretectum) til ILH. Laser-ablation af pretectum blev vist sig at reducere bytte capture aktivitet og afskaffe neuronal aktivitet i den ILH, der er knyttet til visuelle bytte perception21. Her, laser protokoller til at udføre ablation og teste sin virkning ved hjælp af Ca2 + imaging og adfærdsmæssige optagelse i zebrafisk larver er beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom to-foton laser har en fremragende rumlige opløsning til specifikt ablate individuelle neuroner, bør der udvises stor forsigtighed at undgå uønskede skader på hjernevævet på grund af varmen. Det vigtigste skridt i ablation eksperiment er at bestemme den optimale mængde af laser bestråling. Utilstrækkelig bestråling undlader at dræbe neuronerne. For meget bestråling vil varme-skader det omkringliggende væv, som vil resultere i uønskede virkninger. Den optimale vifte af laser bestråling (områder af R…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Disse undersøgelser blev finansieret af tilskud modtaget fra MEXT, JSP’ER KAKENHI Grant numre JP25290009, JP25650120, JP17K07494 og JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
Referências
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neurociência. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
- . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
