Summary

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

Published: June 02, 2018
doi:

Summary

ここでは、ゼブラフィッシュ幼虫からの 2 光子レーザーによる神経細胞の遺伝的標識個体をアブレーションするプロトコルを提案する.

Abstract

動作における神経細胞の亜集団の役割を識別するためには、生きている動物の活動をブロックの結果をテストするのには不可欠です。レーザーアブレーションのニューロンは、神経細胞が選択的に蛍光プローブ付けこの目的のための効果的な方法です。現在の研究では、2 光子励起顕微鏡を使用して、その機能と行動の結果のテストは神経細胞の亜集団をアブレーション レーザーのプロトコルを説明します。本研究ではゼブラフィッシュ幼虫で獲物のキャプチャ動作は研究モデルとして使用されます。Pretecto 視床下部の回路動作をキャッチこの視覚的に駆動される獲物の根底に知られています。ゼブラフィッシュ pretectum レーザー蒸散、視床下部 (または喘鳴症; pretectal 投影のターゲット) の下の葉の神経活動を調べた。Pretectal アブレーション後獲物キャプチャ動作もテストされました。

Introduction

動作が脳の神経細胞の活動から発生する方法を理解するには、行動の生成に関与している神経回路を識別するために必要です。幼虫の段階で、ゼブラフィッシュは、理想的な動物モデル小さく、透明な脳の広範な領域での携帯電話の解像度で神経細胞の活動を調査することが可能になるため、動作に関連付けられている脳機能を勉強して、1の動作を観察しながら脳。特定のニューロンの神経活動のイメージングは、GCaMP2など遺伝的コード化カルシウム (Ca) 指標 (GECIs) の発明によって可能にしました。GCaMP トランスジェニックゼブラフィッシュ行動動物3Ca イメージングを行うことにより、機能的な神経回路動作を関連付けるために有用であると証明しました。

Ca イメージングは、神経活動と行動間の相関関係を示すことが、一方の抑制神経細胞の活動と行動にその consequence(s) をテストは、因果関係を示す、重要な手順です。これを達成するためにさまざまな方法があります: 特定の神経回路4、特定のニューロン5,6ハロロドプシン7などの光遺伝学的ツールの使用で神経毒の発現を変化させる遺伝子の突然変異の使用と対象となるニューロン8,9のレーザーアブレーションします。レーザーアブレーションは比較的少数の特定のニューロンの活動を排除することに特に適しています。神経細胞を殺すことによって神経細胞の活動の不可逆的な除去を促進する行動の結果を評価します。

ゼブラフィッシュの幼虫の段階で観察することができます 1 つの興味深い現象は、獲物のキャプチャ (図 1A) です。この視覚誘導、目的指向行動視力10、視覚運動変換11,12,13視知覚と認識の研究のため有利な実験システムを提供します。オブジェクト14,15,16,17,18, および意思決定19。どのように獲物は神経行動学20の中心的な質問をされている行動をキャッチ捕食者と獲物の検出が獲物につながる方法によって認識されます。本稿で我々 は、pretectum の核の投射によって形成される pretecto 視床下部の回路の役割に焦点を当てる (核 pretectalis 浅パルス大、以下、単に、pretectum として有名)、または喘鳴症に。獲物捕獲活動を減らす visual 獲物知覚21に関連付けられているまたは喘鳴症で神経活動を廃止し、pretectum のレーザー ・ アブレーションを示した。ここでは、実行するプロトコル レーザー アブレーションと幼虫のとおりゼブラフィッシュの Ca2 +イメージングと行動記録を使用してその効果をテストします。

Protocol

1。 2 光子レーザー顕微鏡を用いたニューロンの亜種のアブレーション 注:Ca イメージング次アブレーションを実行する場合は、UAShspzGCaMP6s ライン21を使用します。アブレーションに続く行動の記録を実行する場合は、EGFP 陽性細胞の切除は GCaMP6s 発現細胞のよりも簡単に UAS:EGFP 線を使用します。 調査される特定のニューロン、UAS:EGFP …

Representative Results

特定のニューロンは EGFP と式は Gal4 行で運転された GCaMP6s 遺伝子標識しました。Gal4 ライン gSAIzGFFM119B は、pretectal エリア (大浅 pretectal 核)、および嗅球神経細胞の亜集団の核をラベルに使用されました。別の Gal4 ライン、hspGFFDMC76A、だった、または喘鳴症に使用されます。私たちレーザーアブレーション pretectal ニューロン両側 (図 2…

Discussion

2 光子レーザーには、具体的には個々 のニューロンをアブレーションする優れた空間分解能がありますが、偉大な用心は、暑さで脳組織上の任意の不要な損傷を避けるために取られるべき。アブレーションの実験で最も重要なステップは、レーザー照射の最適な量を決定することです。不十分な照射は、ニューロンを殺すために失敗します。あまりにも多くの照射、熱損傷周囲の組織は、望?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

これらの研究は、文部科学省、日本学術振興会科研費助成番号 JP25290009、JP25650120、JP17K07494、および JP17H05984 から受け取った補助金によって賄われました。

Materials

NuSieve GTG Agarose Lonza Cat.#50080 low-melting temperature agarose
6 cm petri dish FALCON Product#:351007
dissecting needle AS ONE Corporation Cat. No. 2-013-01 https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP Carl Zeiss two-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0 Carl Zeiss 63X objective lens
Imager.Z1 Carl Zeiss an epi-fluorescence microscope
ZEN Carl Zeiss Image acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth Molecular Probes Catalogue # S-24732 Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing Chambers Grace Bio-Labs CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 Used as a behavioral recording chamber
surgical knife MANI Ophthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics model:C11440-22CU a scientific CMOS camera
HCImage Hamamatsu Photonics image acuisition software
Hard Disk Recording module Hamamatsu Photonics An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7 Olympus stereoscope
DF PL 0.5X Olympus objective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio FLIR Systems, Inc. Product No. GS3-U3-41C6NIR-C CMOS camera
XIMEA xiQ camera XIMEA Product No. MQ042RG-CM CMOS camera
a ring LED light CCS Model: LDR2-100SW2-LA White LED
Nylon mesh 32µm Tokyo Screen N-No.380T http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µm Tokyo Screen N-No. 508T-K http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. dry beer yeast
LabVIEW National Instruments an integrated development environment for programming
Mai-Tai HP Spectra Physics  two-photon laser 

Referências

  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neurociência. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
  24. . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  27. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
  28. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
check_url/pt/57485?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Muto, A., Kawakami, K. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57485, doi:10.3791/57485 (2018).

View Video